廣東地區GNB3基因多態性與原發性高血壓遺傳易感性研究

李海燕 黃旭琳 黃梓楊 陳少蓮 張詠莉

近幾年來對GNB3基因多態性與高膽固醇血癥、冠心病、高血脂等關系的研究已成為國內外關注熱點。研究GNB3基因多態性與心血管疾病遺傳易感性將有助于了解GNB3基因在不同人群中分布情況，探索疾病的發病機制。有研究顯示，GNB3 A(-350)G多態性可影響到G2蛋白活性。近年報道GNB3的基因A(-350)G多態性與EH的關系，結果不一致。對德國[1]、澳大利亞人的一些研究報道A(-350)G多態性與EH 有關聯[2]，而來自日本[3]、法國、美國等的一些研究報道則無關聯。到目前為止還未見到關于廣東地區GNB3基因多態性與心血管疾病遺傳易感性的研究報道，研究廣東地區GNB3基因多態性與心血管疾病遺傳易感性并與其他國家和地區人群對比，可以找到廣東地區人群中與心血管疾病遺傳易感性相關的GNB3基因型，對廣東地區心血管疾病做出盡早的預防、診斷和治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年在廣東藥學院第一附屬醫院采集原發性高血壓患者血樣50份，均符合世界衛生組織高血壓診斷標準，相互之間無血緣關系。

1.2 基因組DNA制備

1.2.1 采用傳統的酚-氯仿抽提法。

1.2.2 利用RNA/DNACalculator對所提DNA的質量和濃度進行測量。

1.3 GNB3 A(-350)G位點PCR反應

1.3.1 引物序列

上游5ˊ-AGA GGA TGG TGG GGT TGG GAG G-3ˊ

下游5ˊ-GAG GCT GTG AAA GCA GGG GTC AG-3ˊ

1.3.2 PCR反應體系

反應體系為 50 μl:4 μL DNA 溶液，2.5 U Taq 酶，引物工作液濃度每條為0.4 μM，dNTPs每種終濃度0.2 μM，標準的PCR buffer。

1.3.3 PCR反應條件

預變性 95℃ 5 min，后94℃ 60 s，60℃ 45 s，72℃ 60 s，共35 個循環，72℃ 7 min，4℃保存。

1.3.4 瓊脂糖電泳:

PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳(離子強度0.5×TBE)，100V恒壓電泳30 min及凝膠自動成像分析系統檢測結果。A(-350)G擴增片段長度361bp，約61bp處為本研究觀察G→A突變點。

1.4 測序反應

1.4.1 PAG凝膠配制和灌膠 配制含7 mmol/l尿素的6%變性聚丙烯酰胺凝膠;將洗凈晾干的凝膠板裝上膠架，放置夾緊。量取50 mlPAG膠液，加入10%過硫酸胺260 μl，TEMED 25 μl，混勻后緩慢灌入膠板中，靜止凝固大約3 h。

1.4.2 樣品處理 取12 μl去離子甲酰胺和0.5 μl PE GeneScan400 hD分子量內標，按上述比例混合成Loading Buffer;取7 μl Loading Buffer加入1 μl PCR 擴增產物(1/8 稀釋)，混勻離心，然后于PCR儀上95℃變性4 min，后馬上置于冰上，直至上樣。

1.4.3 測序凝膠電泳 打開計算機和DNA自動測序儀主機，放置凝膠板。若玻板檢測合格，倒入電泳液進行預電泳。停止后點樣。用ABI PrismTM 310 Collection軟件收集數據。電泳條件為1000V，30W，電泳2 h。

2 結果

2.1 人類基因組DNA提取 共提取正常人群和原發性高血壓患群人類基因組樣品100份。

2.2 GNB3 A(-350)G位點的PCR反應 各樣品PCR反應瓊脂糖電泳圖如下。

2.3 GNB3 A(-350)G位點PCR產物測序反應

2.3.1 廣東地區正常人群GNB3 A(-350)G位點測序結果正常人50份樣品無一例突變，基因型均為GG，基因型頻率100%。如N-10樣品GNB3 A(-350)G堿基序列:

GCACTGACCCTCTCTCCGTCTGTGCATAAGGTCGTGAA

GATCT CTCAG CCAGG GGCCA GTCGA GTGTA TCACA GATTC TGTGA

2.3.2 廣東地區原發性高血壓患群GNB3 A(-350)G位點測序結果 患者45份樣品，有2例D-10和D-50發生了G→A突變，基因型為GA，基因型頻率4.4%。如D-10樣品G→A突變堿基序列:

CAATGGCTCTCTCTCAGTCTGTGCATAAGGTCGTGAA

GATCT CTCAG CCAGG GGCCA GTCAA GTGTA TCACA GATTC TGTGA

2.3.3 N10和D10樣品測序圖如下。

2.4 GNB3 A(-350)G位點統計學分析

表1 GNB3 A(-350)G位點等位基因頻率結果

表2 GNB3 A(-350)G位點基因型頻率結果

3 討論

原發性高血壓是一種由多種遺傳和環境因素共同作用所致的復雜的多基因疾病，而且遺傳因素在高血壓人群中可能起著重要的不可忽視的作用。近年來，尋找與高血壓病有關及致病的相關基因越來越受到人們的關注。1998年，Siffert等發現G蛋白β3亞單位(GNB3)基因第10位外顯子存在一個多態位點C825T。T等位基因使G蛋白過度活化，使得細胞Na+/H+交換(NHE)增強，Na+重吸收增加，容量擴張，導致血管強烈收縮及平滑肌增殖，使患高血壓及高血壓相關器官損害危險增加[4]。GNB3基因多態性與高血壓的關系存在種族差異，對不同種族人群進行的研究結果不盡一致，我們的研究結果也顯示GNB3基因A(-350)G多態性的變化存在著種族差異。由表1、表2可見，廣東地區正常和患患者群G等位基因頻率(1.000和0.978)顯著高于非洲地區和德國地區正常人群G等位基因頻率(0.76和0.61)，而A等位基因頻率(0和0.022)顯著低于非洲地區和德國地區正常人群A等位基因頻率(0.24和0.39)，這可能與不同種族內心血管系統疾病患病率的高低存在相關性。所以在白人、黑人和東亞人群中GNB3基因A(-350)G位點等位基因頻率是顯著不同的，而亞洲人分布是否相似還有待于進一步深入研究。經過統計學分析，本次研究高血壓組與正常血壓組的GNB3 A(-350)G位點基因型與等位基因型無顯著性差異，當然，為了進一步確定其關系，需要更多實驗研究和更大的樣本含量，并進行家族分析。

[1]劉文娟，楊文清，王蕾，等.β2腎上腺素受體基因、α上皮細胞鈉通道基因和G蛋白β3亞基基因聯合變異與維吾爾族人群高血壓的關系.中國循環雜志，2009，24(6):446-450.

[2]Adam V，Benjadield，Chery，et al.G-protein β3 subunit gene(GNB3)variant in causation of essential hypertension.Hypertension，1998，32(5):994.

[3]Kato.Association study of G-protein β3 subunit.Hypertension，1998，32(5):934.

[4]韓璐璐，李娜，蔣雄京，等.GNB3基因C825T多態性與美托洛爾藥效的相關性研究.中國新藥雜志，2010，19(9).