C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

李曉沖，張秀英，徐 尚，李 宏，張燕華

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

人類飲食結構的改變，導致非酒精性脂肪肝的發病率逐年上升。非酒精性脂肪性肝病（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括：單純性脂肪變性、脂肪性肝炎和肝硬化3個病理階段。脂肪性肝炎為預后較差的一個階段，可進一步發展為肝硬化甚至肝細胞癌［1］，目前尚無明顯有效的治療方法。動物模型在探索疾病的發病機制、評價診斷方法、篩選防治藥物等領域均有重要作用。近年來，許多學者利用試驗動物復制非酒精性脂肪肝病理模型并對其進行了大量的研究，取得了許多成果。其中C57BL/6J小鼠對高脂較敏感，是理想的建模動物。本試驗采用高脂飼料和高脂與四氯化碳聯合誘導，并比較了兩種誘導方法以及誘導時間對非酒精性脂肪肝的變化與進程的影響，目的是探索建立較理想動物模型的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 近交系 C57BL/6J小鼠，SPF級，9～10周齡，共60只，雄性。由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供，生產許可證號：scxk黑2006－009。

1.1.2 藥物與試劑 所用藥品為分析純由天津虔誠偉業科技發展有限公司提供，生化試劑盒由南京神州英諾華醫療科技有限公司提供，油紅O試劑由Sigma公司提供。

1.1.3 儀器 RM2135切片機，冷凍切片機（德國萊卡公司），英諾華自動生化儀。

1.2 方法

1.2.1 高脂飼料制備 高脂飼料：15%豬油，1%膽固醇，0.5%膽鹽，15%糊精，68.5%基礎飼料。豬油是由市場購買的經檢驗合格的動物脂肪熬制所得。

1.2.2 分組與模型建立 小鼠按隨機原則分為正常組、高脂組和高脂復合四氯化碳組（復合組），每組20只。所有動物適應飼喂1周后，正常組飼喂普通飼料，高脂組飼喂高脂飼料，復合組除飼喂高脂飼料外，首次每只小鼠以0.72mL/100g劑量皮下注射CCl4溶液，以后每周1次以0.42mL/100g劑量皮下注射40%的CCl4－植物油（V/V）溶液，連續3周。各組分別于第4、6、8周，取5只小鼠進行稱重剖殺，取血分離血清，剖檢，取肝臟稱濕重；取肝組織固定，分別進行H.E.染色和油紅O染色，做病理學檢查。

1.2.3 觀察指標和測定方法 一般檢查：試驗期間每周稱小鼠體量1次，并觀察其毛色、食欲、行動、對外界刺激的反應情況；病理組織學檢查：肉眼觀察小鼠肝臟大體變化，采用H.E.染色和油紅O染色，光鏡下觀察小鼠肝臟病變；血液生化指標的檢測：谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、谷酰轉肽酶（GGT）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（T－CHO）等血液生化指標采用全自動生化儀分析。

1.2.4 評價標準及統計學處理 判斷標準參見中華肝病學會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》（2010年修訂版）［2］。計量資料用X±S表示，兩組間均數的比較采用t檢驗，用SAS9.1軟件統計分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠一般指標 試驗過程中，與對照組小鼠相比，高脂組和復合組小鼠毛發油膩、凌亂。食量減少，對外界刺激的反應較遲鈍。與對照組小鼠相比，高脂組和復合組小鼠體重均呈下降趨勢，且差異極顯著（P＜0.01）；肝指數上升，第4周差異顯著，6～8周差異極顯著（P＜0.01）。復合組與高脂組相比，第8周肝指數差異達顯著水平（P＜0.05）。見表1。

表1 小鼠體重、肝重和肝指數比較

2.2 病理學變化 肉眼觀察，8周時，正常組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質軟有彈性；高脂組與復合組小鼠肝臟腫大易碎、包膜稍緊張、邊緣圓鈍、呈棕黃色、切面有油膩感，且膽囊變色。結果如中插彩版圖1所示。光鏡下，正常組小鼠肝細胞正常，肝索排列整齊，肝小葉結構正常。高脂組4周，脂肪變性的肝細胞占2/3以上，呈魚網狀，8周可見氣泡樣變與凋亡的肝細胞，炎性細胞浸潤。復合組4周時，脂肪變性的肝細胞占2/3以上，有炎性細胞浸潤。8周時，有炎性細胞浸潤灶，出現纖維化和大量氣泡樣變的肝細胞。油紅O染色可見，8周時高脂組比復合組小鼠肝臟的橘紅色脂滴廣泛，復合組中肝臟的肝竇擴張。見中插彩版圖2～9。

2.3 血液生化指標 4周時，高脂組和復合組血清中TG和T－CHO水平均顯著高于對照組。8周時高脂組TG含量又顯著高于復合組（P＜0.05）。4周時，高脂組和復合組小鼠血清中的轉氨酶明顯升高，其中GPT水平均顯著高于對照組，且保持較平穩的高水平。復合組中GOT、GGT水平與高脂組也有顯著差異（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠血清中 GPT、GOT、GGT、TG和T－CHO比較

3 討論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除過量飲酒和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過量沉積，是一類獲得性的代謝應激相關性肝病。為深入研究非酒精性脂肪肝的發病機制，建立一個與人類病變相似的動物模型極為重要。目前國內外主要采用高脂飼喂Wistar或SD大鼠，或是膽堿－蛋氨酸缺乏飲食（MCD）C57BL/6J小鼠模型。前者炎癥的產生和造模時間較長，后者可以較快復制模型，但模型中血清TG和肝指數下降，且由于缺少膽堿和蛋氨酸成分，不符合人類實際的飲食情況［3－4］。人類生活中高脂飲食是導致非酒精性脂肪肝主要因素，而使用的一些藥物或是攝入的毒性物質也在損傷肝臟［5］。本試驗采用高脂飲食和復合誘導兩種造模方法。

試驗中高脂組和復合組肝指數顯著高于正常組。考慮到高脂飼料較油膩，小鼠采食量下降，所以體重下降。相比體重的變化，其肝指數的變化更有意義。試驗中小鼠沒有表現肥胖癥狀，但有相關文獻報道，人類體重正常時也存在發生NAFLD［6］。試驗中病理組織檢驗結果，經判定符合建模標準［2］。高脂組在4周時，已形成明顯的脂肪變性，在8周時有少量炎性細胞。由于四氯化碳的作用，復合組較高脂組有明顯的炎性浸潤，且肝臟損傷明顯。并且兩組中膽囊出現不同程度變化，出現炎癥。膽囊炎和膽結石在非酒精性脂肪肝病也時常發生［7］。

高脂組與復合組TG含量不穩定，總體呈升高趨勢。8周時，高脂組顯著高于復合組。高脂組與復合組T－CHO含量都明顯高于正常組，且在4～8周較穩定。兩組造模結果符合NAFLD中的高脂血癥。試驗中給予高脂飼料的小鼠TG與T－CHO呈上升趨勢，這與NAFLD患者中甘油三酯（TG）、總膽固醇（T－CHO）水平明顯高于對照組的文獻報道相符［8］。

試驗4～8周高脂組和復合組GPT含量明顯高于正常組，符合建模標準［2］。血清GPT升高是反映肝臟損傷的標志之一，在GPT、GOT及GGT等肝酶中，GPT與肝臟脂肪聚集關系最為密切，并且文獻報道GPT的升高可能會早于NAFLD［9］。復合組的GOT含量較高脂組要高，且在8周時，顯著高于高脂組。這與肝細胞損傷程度有關。文獻報道，血清GOT增高與NAFLD的進展性肝纖維化相關［6］。可見CCl4在誘導過程中，促進了肝損傷和纖維化的進程，也證實了外界的毒性物質促進非酒精性脂肪肝的發展。模型組中血清酶學指標的升高與文獻報道的結果一致，符合日常檢測的NAFLD患者血清酶學指標［8、10］。

本試驗在考慮高脂飼料與化學性物質作用的因素下，結合以上各種分析，高脂組在高脂誘導4周后，得到的模型已符合人體NAFLD的主要特征。且得到的生化指標可作為進一步研究的參考。復合組中合用了化學性誘導物質，主要考慮實際生活中，人們不可避免地會接觸到各種化學毒性物質。四氯化碳可促使肝臟的炎癥和纖維化，與高脂合用對非酒精性脂肪肝疾病進程有促進作用。復合組8周可以考慮作為NAFLD的肝臟纖維化病變模型。研究結果為進一步研究發病機制及有效防止藥物奠定了基礎。

［1］ Weston S R，Leyden W，Murphy，etal.Racial and ethnic distribution of nonalcoholic fatty liver in persons with newly diagnosed chronic liver disease［J］.Hepatology，2005，41：372－379.

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［3］ 周光德，趙景民.非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）病理學評價、無創性診斷指標篩選、發病機制及藥物干預研究 ［D］.北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院，2007：5.

［4］ 劉俊平，范竹萍.從新視角評價非酒精性脂肪性肝炎動物模型［J］.胃腸病學，2008，13（8）：502－504.

［5］ Eksted M，Franzen L E，Mathiesen U L，etal.Statins in nonalcoholic fatty liver disease and chronically elevated liver enzymes：A histopathological follow－up study［J］.Journal of Hepatology，2007，47：135－141.

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［7］ 盛黎，范竹萍，汪曉紅，等.非酒精性脂肪性肝病伴膽石癥的臨床與病理學研究 ［J］.肝臟，2009，14（5）：377－379.

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