豬附紅細胞體DnaJ基因PCR診斷方法的建立及應用

張 影，賈立軍，薛書江，錢年超，張守發

（延邊大學農學院動物醫學系，吉林 延吉133002）

附紅細胞體病是由附紅細胞體（Mycoplasma）寄生于多種動物和人紅細胞表面及血漿、骨髓內而引起的一種人獸共患病。目前，針對附紅細胞體病的診斷已建立了多種檢測技術，補體結合試驗、熒光抗體試驗、間接血凝試驗、酶聯免疫吸附試驗等血清學技術已用于檢測附紅細胞體抗體［1－3］。但國內外比較公認的是檢測到病原體的存在，常用的方法有姬姆薩染色鏡檢病原體和PCR檢測核酸的方法，Gwaltneys等證實PCR方法是進行附紅細胞體病診斷和研究的一種有價值的方法，而且具有較高的特異性和敏感性［4－6］。本試驗選擇了豬附紅細胞體熱休克蛋白DnaJ基因建立豬附紅細胞體病PCR診斷方法，旨在為豬附紅細胞體病的快速診斷建立準確、特異、敏感的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 血樣來源 豬附紅細胞體陽性血樣由延邊大學預防獸醫學實驗室鑒定并保存，53份待檢豬血液樣品采自吉林省延邊地區。

1.2 試劑 血液基因組DNA提取試劑盒、dNTP、ExTaq酶、瓊脂糖、DNA Marker 2 000等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑為進口或國產分析純產品。

1.3 引物設計 根據GenBank上發表的豬附紅細胞體（豬支原體 NC＿015153.1）全基因組序列中DnaJ基因序列，應用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31軟件設計了1對特異的引物D1和D2，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

引物序列為：上游D1：5′－ATCATCCCGACATTAACAA－3′；下游 D2：5′－CCCATTCCCTTTAGT－TTCA－3′。

1.4 附紅細胞體DNA的提取 豬附紅細胞體陽性血樣基因組DNA按照全血基因組DNA提取試劑盒的操作說明書進行。

1.5 PCR擴增、退火溫度的篩選 以提取的豬附紅細胞體DNA為模板，進行PCR擴增，反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，退火溫度梯度為53℃～59℃45s，30個循環，最后72℃延伸5min。

1.6 PCR擴增產物的回收、鑒定與測序 將868 bp的PCR擴增產物片段按照DNA提取試劑盒說明對目的片段進行回收純化，經瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，將回收的目的片段克隆連接到pMD18－T載體上，轉化到大腸桿菌E.coliDH5α感受態細胞中，在氨芐平板上篩選出陽性克隆，將陽性克隆菌送往上海英駿生物技術有限公司測序。

1.7 特異性試驗 分別以犬新孢子蟲、牛附紅細胞體、犬附紅細胞體、牛瑟氏泰勒蟲的DNA為模板，按照最佳反應條件進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.8 敏感性試驗 用紫外分光光度儀測定上述提取的豬附紅細胞體DNA的OD260nm值，計算DNA含量。以10倍為梯度連續稀釋成6個不同濃度，用最佳反應條件進行PCR擴增，以此來確定PCR方法的敏感性。

1.9 DnaJ基因PCR與姬姆薩染色鏡檢的比較 將采自吉林省延邊地區的53份待檢豬血液樣品，進行DnaJ基因PCR檢測，同時與姬姆薩染色鏡檢進行比較。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增 以豬附紅細胞體DNA為模板，經PCR擴增出大小為868bp的基因片段，與預期結果相符（圖1）。

2.2 最適退火溫度的篩選 對豬附紅細胞體DNA進行梯度PCR擴增，在56℃時條帶最亮，將56℃定為最佳退火溫度（圖2）。

2.3 陽性質粒的測序結果 PCR產物測序結果如圖3所示，下劃線位置為引物位置，序列分析表明與GenBank中（NC＿015153.1）同源性為99%。

2.4 特異性試驗 以豬附紅細胞體、犬新孢子蟲、牛附紅細胞體、犬附紅細胞體、牛瑟氏泰勒蟲的DNA為模板，以D1、D2為引物，進行PCR擴增。結果顯示，只有豬附紅細胞體在868bp處擴增出了特異性條帶，其他樣品無特異性條帶（圖4），說明該方法具有較好的特異性。

2.5 敏感性試驗 取PCR檢測為豬附紅細胞體病陽性血液DNA，按101～106進行倍比稀釋，用D1、D2引物對不同稀釋倍數的DNA依次進行PCR擴增。結果顯示，樣品經稀釋后，經PCR擴增能檢出106倍稀釋的DNA，此時DNA的濃度值為124fg/μL。

2.6 DnaJ基因PCR與姬姆薩染色鏡檢的比較以53份豬血液樣本DNA為模板，進行DnaJ基因PCR擴增，與姬姆薩染色鏡檢結果進行比較。結果顯示，檢測的53份血液樣本，DnaJ基因PCR方法的豬附紅細胞體陽性檢出率為86.8%（46/53），姬姆薩染色鏡檢方法的豬附紅細胞體的陽性檢出率為15.1% （8/53），其中染色鏡檢為陽性的血液樣本，PCR檢測也均為陽性（表1）。

表1 DnaJ基因PCR擴增和姬姆薩染色鏡檢方法的比較

3 討論

近年來，由于附紅細胞體病具有廣泛的流行性、高度的感染性，該病的感染動物數量和種類也呈上升趨勢［7－8］。有關附紅細胞體病的病原學、分子生物學診斷技術的研究已取得了一定進展，其中PCR方法具有快速、敏感、準確等特點，對豬附紅細胞體病的檢測具有高度的特異性和敏感性，對隱性感染豬群具有良好的檢測效果。本試驗經對53份現地血液樣品的檢測發現，PCR檢測則為陽性率高于姬姆薩染色鏡檢陽性率，說明本試驗建立的PCR檢測方法比染色鏡檢方法更為敏感，能夠檢測到豬附紅細胞體病的隱性感染，為提早的預防和治療該病提供了重要的參考價值。

本試驗基于豬附紅細胞體DnaJ基因的序列，設計一對特異性引物，經PCR擴增出約868bp大小的基因片段，并進行PCR條件的優化，建立了豬附紅細胞體DnaJ基因PCR檢測技術。通過血涂片姬姆薩染色鏡檢和PCR方法對53份血樣進行豬附紅細胞體的檢測比較，結果PCR檢測方法的陽性檢出率明顯高于姬姆薩染色鏡檢，進一步證明了PCR檢測方法的靈敏度高，更適合對豬附紅細胞體的檢測。

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