耐藥金黃色葡萄球菌gyrA基因突變與中藥耐藥抑制劑的回復突變研究

游思湘，孟海波，符晨星，瞿俊勇，劉湘新

（1.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙410128；2.湖南農業大學動物科技學院，湖南 長沙410128）

氟喹諾酮類藥物對金黃色葡萄球菌發揮抗菌作用的靶位是拓撲異構酶Ⅳ和DNA旋轉酶，因此將DNA旋轉酶基因和拓撲異構酶Ⅳ基因統稱為藥物靶位酶基因，這些基因的突變引起靶位酶結構的改變，可使金黃色葡萄球菌逃逸氟喹諾酮類藥物的殺滅作用而產生耐藥［1－2］。為了探討金黃色葡萄球菌對氟喹諾酮類的耐藥性與gyrA基因突變的關系及中藥耐藥抑制劑－復方黃連制劑對耐藥金黃色葡萄球菌gyrA基因的影響，選取金黃色葡萄球菌敏感標準株ATCC29213，采用人工逐步誘導方法獲得MIC值為64μg/mL、128μg/mL和256μg/mL的耐藥突變株。PCR擴增金黃色葡萄球菌敏感菌標準株、耐藥株和復方黃連制劑處理的耐藥株gyrA基因，產物回收純化后送測序公司測序。用DNA－sis軟件分析測序結果，通過比較3種菌株的gyrA基因堿基序列和氨基酸序列差異，找出細菌的耐藥與gyrA基因堿基和氨基酸序列突變的關系及復方黃連制劑是否具有回復突變作用，以便從分子水平初步探討中藥耐藥抑制劑－復方黃連制劑的耐藥逆轉分子機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 復方黃連制劑：含生藥1g/mL，由湖南農業大學動物醫學院藥學系制備，該制劑各指標符合《中國藥典》規定。諾氟沙星原料藥：由湖南農業大學動物藥業有限公司提供，含量為98.5%。藥敏紙片：杭州天和微生物試劑有限公司。菌株：金黃色葡萄球菌質控菌株ATCC29213，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法 耐諾氟沙星金黃色葡萄球菌人工誘導耐藥株的建立：采用人工逐步誘導方法。將金黃色葡萄球菌標準株ATCC29213 100μL于含諾氟沙星濃度為8μg/mL的MH肉湯中置于37℃振蕩培養箱中培養18h；取100μL菌液在含藥瓊脂上涂板，置37℃恒溫培養箱中培養18h，觀察細菌生長情況，再將細菌接種于含諾氟沙星16μg/mL MH肉湯中培養，以此類推，將金黃色葡萄球菌置于含諾氟沙星濃度32、64、128、256μg/mL的肉湯中依次誘導。測定各菌株的MIC，并經過5次無藥平皿上傳代證實為非適應性生長后保存備用。

中藥處理株的建立：將人工誘導建立的各種耐藥金黃色葡萄球菌菌液稀釋到1×108CFU/mL，取100μL加入含有抑菌濃度復方黃連制劑的MH肉湯培養基中37℃振蕩培養3代，即得中藥處理株。

試驗分組：試驗分為敏感標準株組、耐藥株組和中藥處理株組3組。

引物的設計與合成：根據GenBank中金黃色葡萄球菌DNA旋轉酶gyrA基因序列，采用Primer5軟件設計gyrA基因引物，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游（forward）引物為：P1 5′－CATTGCCAGATGTTCGTGATGG－3（22bp）；下游（reverse）引物為：P2 5′－ACCACGACCTGTTTCA TATGCA－3（22bp）。

PCR反應體系：為50μL體系：dNTP：4μL；10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL；Taqplus酶1μL；gyrA F 1μL；gyrA R 1μL；超純水37μL；總DNA1μL。

PCR反應條件：95℃熱啟動5min后加Taqplus DNA聚合酶；94℃ 變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環；最后72℃溫育7min。

瓊脂糖凝膠電泳［3］：1.0%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳，電壓恒定為150V，30min，以DNA Marker（DL－2 000）為標準分子量。電泳結束后，取膠在凝膠成像系統拍照記錄結果。

PCR產物的回收與測序及序列分析 用DNA回收試劑盒回收PCR產物，純化后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，用DNAsis軟件分析測序結果。

2 結果

2.1 gyrA基因PCR產物電泳結果 人工誘導的SAR－1、SAR－2和SAR－3耐藥突變株和經復方黃連制劑處理的3株耐藥突變株gyrA的基因序列在596bp處擴增出了DNA旋轉酶亞單位A基因（gyrA）目的條帶，結果見圖1。

圖1 gyrA基因PCR產物部分電泳圖譜

2.2 金黃色葡萄球菌標準株、耐藥突變株及復方黃連制劑處理的耐藥突變株gyrA基因突變分析結果 標準株、突變株及復方黃連制劑處理的耐藥突變株gyrA基因所測序列用DNAsis軟件分析結果見表1。結果表明，與金黃色葡萄球菌敏感標準菌（ATCC29213）的gyrA基因序列相比，突變株SAR－1、SAR－2和SAR－3gyrA 基因序列均發生了125位堿基C→ T突變；SAR－3還發生了251位堿基C→T、295位堿基A→G突變。經復方黃連制劑處理后的突變株SAR－1和SAR－2gyrA基因堿基無回復突變；但SAR－3發了251位堿基T→C、295位堿基G→A的回復突變，即回復到與標準株相同。

2.3 金黃色葡萄球菌標準株、耐藥突變株及復方黃連制劑處理的耐藥突變株gyrA基因氨基酸序列分析結果 由DNAsis軟件分析，與金黃色葡萄球菌敏感標準菌（ATCC29213）的gyrA基因氨基酸序列比較，突變株SAR－1、SAR－2和SAR－3gyrA 基因的氨基酸序列均發生42位絲氨酸（Ser）→苯丙氨酸（Phe）突變；SAR－3還發生了84位絲氨酸（Ser）→纈氨酸（Val）和99位賴氨酸（Lys）→谷氨酸（Glu）。SAR－1和SAR－2經復方黃連制劑處理后，氨基酸序列沒有發生回復突變；但SAR－3發生了84位纈氨酸（Val）→絲氨酸（Ser）和99位谷氨酸（Glu）→賴氨酸（Lys）的回復突變。

3 討論

3.1 gyrA基因序列突變與細菌耐藥性的關系 本試驗建立的對諾氟沙星 MIC值為64μg/mL、128 μg/mL和256μg/mL的耐藥突變株gyrA基因序列均發生了125位堿基C→T的突變，MIC為256 μg/mL的耐藥株，除以上突變點外，還發生了251位堿基C→T、295位堿基A→G突變。這表明細菌的耐藥性程度越高，堿基突變率增加。由此可見，細菌以DNA旋轉酶為基礎而形成的耐藥性是逐步積累發展起來的，要獲得高水平的耐藥，需多位點的突變，需要更高的MIC。

3.2 gyrA基因氨基酸突變與細菌耐藥性的關系杜悅等［4］探討金黃色葡萄球菌的氟喹諾酮耐藥性與gyrA、gyrB基因突變的關系，結果表明，金黃色葡萄球菌的氟喹諾酮耐藥性與gyrA的絲氨酸（Ser）85→亮氨酸（Leu）和絲氨酸（Ser）84→脯氨酸（Pro）突變密切相關，結論是：gyrA突變是金黃色葡萄球菌對氟喹諾酮耐藥水平增高的主要原因。閉興明等［3］探討了金黃色葡萄球菌菌gyrA、gyrB、grlA、grlB和norA基因突變與環丙沙里耐藥性的關系，結果表明：gyrA中的2個突變（位于84和88密碼子）與環丙沙星耐藥性明顯相關，gyrA中多個點突變的結合往往較單一點突變菌株表現有更高的環丙沙星的 MIC。據資料報道［5－7］：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、流感桿菌、淋球菌、痢疾桿菌、沙門菌等gyrA 83位均為絲氨酸，耐藥突變后多被疏水性氨基酸，如亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨所替代，導致該位點因親水性降低而產生耐藥。本試驗結果也發生了類似的突變：84位親水性絲氨酸被疏水性纈氨酸取代。我們發現84位和99位氨基酸突變與高濃度耐藥有關。此外，有關gyrA基因上新的突變位點已有報道［8］，不同細菌，不同藥物誘導及細菌的不同生長期，可能都會導致其突變位點的改變。

表1 標準株、耐藥突變株和中藥處理株gyrA基因堿基與氨基酸序列突變分析

3.3 復方黃連制劑對gyrA基因的回復突變作用經復方黃連制劑處理的高水平、多位點耐藥菌gyrA基因序列和氨基酸序列可發生部分回復突變作用，因此使耐藥突變株對諾氟沙星敏感性又大大提高。試驗結果表明，84位和99位氨基酸突變與細菌的高水平耐藥性有密切的關系。復方黃連制劑對84位和99位氨基酸具有回復突變的作用，因此具有耐藥抑制作用。但為何對其他突變堿基沒有回復突變，有關機理還有待進一步的研究。

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