奶牛乳房炎分離大腸桿菌的耐藥性及脈沖場凝膠電泳分型研究

余 婷，安慧慧，吳聰明，王桂琴

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川750021；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193）

近年來由于奶牛乳房炎在許多國家都有發生，因此給畜牧業帶來了巨大的經濟損失。目前，致病性大腸桿菌是人類和動物臨床上最常見的病原之一，是威脅人類和動物健康的重要致病菌，也是近年來食品衛生、給水衛生及流行病學領域最重要的研究對象之一［1］。

本試驗對寧夏地區奶牛乳房炎大腸桿菌進行分離鑒定，同時對分離到的細菌進行了耐藥性研究以及PFGE分子分型試驗，從而探討大腸桿菌在寧夏地區奶牛場的耐藥情況及分子流行病學特征，以期為該地區大腸桿菌引起的奶牛疾病治療提供理論參考，并為耐藥機制的研究打下基礎。

1 材料與方法

試驗材料

1.1.1 菌株來源 66株試驗菌株分離自寧夏地區6個奶牛場的乳房炎病例。

質控菌株大腸桿菌ATCC25922，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑藥品 麥康凱培養基、大腸桿菌屬細菌生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；大腸桿菌顯色培養基，購自CHROMagar公司；抗菌藥物標準品：頭孢唑啉、頭孢噻肟、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環素、多西環素、氟苯尼考、多粘菌素、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺甲氧嘧啶，均購自中國獸醫藥品監察所；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS），購自國藥集團化學試劑有限公司；PFGE電泳級瓊脂糖，購自Bio－Rad公司；蛋白酶K、限制性內切酶（XbaⅠ），購自寶生物工程（大連）有限公司。

試驗方法

1.2.1 樣品采集 對奶牛進行乳房炎檢測之后，采集隱性和臨床型乳房炎的奶樣，牛只按常規擠奶消毒后，每個乳頭擠去頭2～3把乳后無菌取奶樣5 mL左右，貼好標簽，送實驗室進行分離鑒定。

1.2.2 分離培養和初步鑒定 將采集的乳樣用滅菌的棉簽涂于麥康凱培養基上，置于37℃培養18～24h，挑取單個典型菌落涂片，革蘭染色鏡檢，觀察細菌形態及染色特性，進行初步鑒定。再將鏡檢后的疑似大腸桿菌的菌落劃線接種于新鮮制備的大腸桿菌顯色培養基平板上，37℃培養18～24h后，觀察其菌落形態特征。

1.2.3 大腸桿菌生化鑒定管鑒定 采用16種與TH－16S編碼冊配套的大腸桿菌屬細菌生化鑒定管進行鑒定。

1.2.4 大腸桿菌的藥物敏感性試驗（MIC值測定）按微量稀釋法［2］對已分離鑒定出的66株大腸桿菌進行16種藥物的MIC值測定，判斷結果采用美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2012年確定的標準。

1.2.5 大腸桿菌PFGE分型 將保存的甘油菌劃線接種于BHI平板，37℃培養18～24h，然后進行PFGE試驗［3］。

2 結果

2.1 大腸桿菌鑒定 大腸桿菌在顯色培養基上為藍綠色菌落；其他非大腸桿菌腸桿菌科細菌在該培養基上為紫色或無色菌落。經生化試驗共分離鑒定出大腸桿菌66株。

2.2 大腸桿菌的藥敏試驗 分析66株大腸桿菌對臨床常用的16種抗菌藥物的耐藥率（見表1）及多藥耐藥情況（見圖1）。從表1可以看出，大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高，達到了89.39%，其次，對鏈霉素、四環素、多西環素、頭孢菌素類抗生素和磺胺甲氧嘧啶的耐藥率也都在50%以上。對阿米卡星、卡那霉素、多粘菌素、氟苯尼考及喹諾酮類藥物則比較敏感。

表1 66株大腸桿菌對16種抗菌藥物的耐藥率

由圖1可知，66株菌中以8耐菌株為主，共12株，占總菌株數的18.18%，其次為5耐、7耐及4耐的菌株，所占比例分別為 13.64%、12.12% 及10.61%，分離菌株最多耐受15種抗菌藥物。

2.3 大腸桿菌PFGE分型結果 本試驗對66株大腸桿菌進行了PFGE分型，菌株染色體DNA經PFGE可產生14～17條帶（見圖2），從圖中可以看出，有些泳道PFGE帶型相近，說明具有同源性，但有12株菌的電泳條帶為降解的抹帶，重復2次還是如此，即此12株臨床株未能分型。

圖2 部分大腸桿菌PFGE分型電泳圖譜

通過應用Bio－Rad公司的InfoQuest FP軟件進行聚類分析，不同亞型相似度在85%以上，即可判定為屬于同一個型。見圖3，54株大腸桿菌進行PFGE分型后，共獲得A－a 27型32個亞型。其中，B、T、V、Z型各5株，a型4株，A、G、P型各3株，C型和O型各2株，其余的各1株。

3 分析與討論

3.1 隨著抗菌藥物的廣泛應用或在疾病治療中不當使用，獸醫臨床大腸桿菌耐藥菌株不斷增多［4－5］，耐藥現象越來越普遍。雷連成［6］曾報道，動物源大腸桿菌的耐藥譜普遍比人源大腸桿菌的耐藥譜廣泛，而且耐藥強度也比人源大腸桿菌強。這一現象說明，由于獸醫臨床大劑量、大范圍、種類無限制使用抗菌藥，導致動物源性病原菌耐藥現象異常嚴重［7］。本試驗對66株臨床分離的奶牛乳房炎大腸桿菌進行了藥物敏感性試驗，結果發現，分離株對環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物都表現出敏感性，這與李宏勝［8］等報道的喹諾酮類藥物對大腸桿菌表現出較好的抑菌效果相一致。

3.2 脈沖場凝膠電泳（PFGE）作為一項分子分型技術，以其重復性好、分辨力強而被譽為細菌分子生物學分型技術的“金標準”［9］。本試驗應用PFGE分型技術對寧夏地區6個奶牛場乳房炎分離的66株大腸桿菌進行了分型，結果獲得27個型32個亞型，Dai［10］等對來自不同養殖場的16株多重耐藥的雞源大腸桿菌進行PFGE分析，結果有16個不同的PFGE譜型。李琳［11］對主要集中于3個養殖場采集的50株ESBLs陽性大腸桿菌進行PFGE相關性分析，發現有44個完全不同的PFGE譜型。從本試驗結果還可以看出，PFGE譜型相同的菌株既有分離自同一牛場的，也有分離自同一地區不同牛場的，分離自同一牛場的菌株也有不同的譜型。而同一牛場分離的菌株間有同源性，說明菌株間存在垂直傳播；同一地區不同牛場之間有同源性，說明菌株間存在水平傳播，表明在寧夏地區的奶牛場分離的菌株之間既存在垂直傳播也存在水平傳播。

在PFGE的研究中，多數進行了耐藥性與PFGE分型的相關性探討，但很難得到確切的結論。本試驗發現，相同PFGE分型的菌株其耐藥譜型不一定相同，而不同PFGE分型的菌株也可擁有完全相同的耐藥譜型，這與楊玲麗［13］所報道的結果相同。由此提示同一克隆型的菌株在增殖播散的過程中存在耐藥質粒的獲取或丟失，導致耐藥性的改變，使其有不同的耐藥譜；而不同克隆株之間可能通過耐藥質粒水平傳播耐藥性，故其耐藥譜可能相同［13－14］。

［1］ 陳燕杰，孟春萍.大腸桿菌耐藥機制的研究進展［J］.獸醫導刊，2010，10：46－48.

［2］ CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Twenty－second informational supplement.CLSI document M100－S22.Clinical and Laboratory Standards Insititute Wayne PA USA，2012.

［3］ 何濤.動物園靈長類動物腸桿菌科細菌耐藥性調查研究［D］.北京：中國農業大學動物醫學院，2008：36－38.

［4］ 王正兵，嚴作廷，羅金印，等.我國奶牛乳房炎常見病原菌的耐藥性檢測［J］.貴州農業科學，2011，39（4）：139－141.

［5］ 高維波.大腸桿菌病的危害及防治對策［J］.山東畜牧獸醫，2011，32（4）：31－32.

［6］ 雷連成.細菌的耐藥性［J］.中國獸藥雜志，2002，36（11）：41－44.

［7］ 丁良君，張秀英，付銳，等.大腸埃希氏菌多重耐藥性與整合子的研究［J］.中國獸醫雜志，2008，44（3）：140－16.

［8］ 李宏勝，羅金印，李新圃，等.我國奶牛乳房炎病原菌區系調查及抗生素耐藥性監測［C］//中國畜牧獸醫學會家畜內科學分會第七屆代表大會暨學術研討會論文集.南昌：中國畜牧獸醫學會家畜內科學分會，2011：726－733.

［9］ Sandt C H，Krouse D A，Cook C R，etal.The key role of pulsed－field gel electrophoresis in investigation of a large multiserotype and multistate food－borne outbreak of Salmonella infections centered in Pennsylvania［J］.Clin Microbiol，2006，44（9）：3208－3212.

［10］Dai L，Lu L M，Wu C M，etal.Characterization of antimicrobial resistance among Escherichia coliisolates from chickens in China between 2001and 2006［J］.FEMS Microbiol Lett，2008，286（2）：178－183.

［11］李琳.雞源大腸桿菌耐藥性流行趨勢及β－內酰胺酶基因分布特征研究 ［D］.北京：中國農業大學動物醫學院，2009.

［12］楊玲麗，陳杖榴，劉健華，等.動物、環境及飼養員多重耐藥大腸桿菌的PFGE分型研究［J］.中國農業科學，2005，39（12）：2597－2602.

［13］Tenover F C，Arbeit R D，Goering R V，etal.Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed－Field Gel Electrophoresis：Criteria for Bacterial StrainTyping［J］.Clin Microbiol，1995，33（9）：2233－2239.

［14］李慶雷，柴同杰，劉巍.ERIC－PCR和PFGE對大腸埃希菌由舍內向舍外傳播的鑒定及兩種方法的比較［J］.動物醫學進展，2010，31（5）：112－117.