矢車菊素在體外緩解脂肪變性的L02肝細胞的氧化損傷

屠 迪，易金娥，鄔 靜，文利新，2，薛立群

（1.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙410128；2.長沙綠葉生物科技有限公司，湖南 長沙410128）

隨著集約化飼養的發展，高能量日糧與極低運動量所誘發的氧化應激對養殖業發展的影響越來越嚴重，如何減少或緩解畜禽體內的氧化應激已經成為現代養殖業的重大課題。大部分具有抗氧化清除自由基的植物提取物均有緩解機體氧化損傷促進機體健康的能力。矢車菊素（Cyanidin，CY）是花青素（Anthocyanidin）的一種，廣泛存在于植物中，屬黃酮類（flavonoids）化合物。CY是純天然的抗氧化劑，目前對CY的研究主要集中與抗腫瘤、調節神經系統等方面，此前的研究表明CY可以有效調節高能量日糧造成的脂代謝障礙，而其對脂代謝障礙時肝細胞氧化損傷的影響未見報道。CY對體外培養的細胞具有保護作用，該保護作用可能與其抗氧化能力有關。在體外CY通過下調TNF－α水平并減少活性氧（ROS）從而降低細胞的凋亡率［1］，抵抗TNF－α及雙氧水所誘導的細胞凋亡［2］，并有效抵抗紫外線誘導的上皮細胞凋亡［3］。作者前期的研究發現，在體外CY有效降低脂代謝障礙肝細胞凋亡率，上述作用可能與CY的抗氧化應激作用有密切關系。因此，本試驗采用人肝L02肝細胞制作脂代謝障礙模型并研究CY對此模型抗氧化能力的影響，為CY在脂代謝障礙過程中抗氧化應激研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗用CY、軟脂酸（PA）和DMSO，購自Sigma公司；RPMI1640培養基為Gibco公司產品，胎牛血清（FBS）由杭州四季青公司生產，試驗用L02人肝細胞系，購自中南大學湘雅醫學院實驗中心。

1.2 試驗設計 首先參考熊清芳所述方法適當調整后制作脂代謝障礙模型［4］，具體方法為：在含有5%CO2飽和濕度條件下，以RPMI1640為培養基，培養體內含有 30mg/mL PA、0.5%DMSO 和10%FBS的條件下培養24h使L02細胞發生明顯的脂肪變性。將L02細胞分為4組，1組為模型對照組，2、3、4組試驗組。模型建立后更換造模培養基1次，各組培養體系內分別添加終濃度為0、0.01、0.1、1mg/mL的矢車菊素繼續培養12h。

1.3 樣品處理 試驗結束后，用細胞刮刀刮下細胞，連同培養基一起收集后3 000r/min離心10min，收集沉淀細胞；采用RIPA強裂解液4℃裂解30min，每10min顛倒一次裂解液；4℃條件下12 000r/min離心5min，取上清液4℃待測。

1.4 測定指標與方法 測定各組細胞內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活性，丙二醛（MDA）含量以及總抗氧化能力（TAOC）。其中SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定；GSH－Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定；TAOC采用FRAP（化學比色法）測定。采用考馬斯亮藍（BCA）法測定樣品中總蛋白含量。總蛋白、MDA、SOD、GSH－Px與 T－AOC測定試劑盒，均購自碧云天生物技術研究所。

1.5 數據分析和處理 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理，采用t檢驗分析組間差異顯著性。

2 結果

2.1 CY對模型細胞SOD活性的影響 由圖1可知，各試驗組細胞中SOD活性較對照組均有所升高，并隨著CY劑量的增加而增強，呈明顯的量效遞增關系。與對照組相比，第3組細胞內SOD活性升高顯著（P＜0.05）而第4組L02細胞內SOD活性升高極顯著（P＜0.01）。

2.2 CY對模型細胞GSH－Px活性的影響 由圖2可知，在CY的作用下，各試驗組L02肝細胞內GSH－Px活性均有所提高，但2、3組細胞內GSH－Px活性升高與對照組相比沒有統計學上的差異，4組細胞內GSH－Px的活性升高相對顯著（P＜0.05）。

2.3 CY對模型細胞內 MDA含量的影響 由圖3可知，各試驗組中MDA含量較對照組均有降低，并隨著CY計量的增加呈現量效遞減關系。與對照組相比，試驗組2細胞內的MDA含量降低顯著（P＜0.05），3、4試驗組細胞內 MDA含量降低極顯著（P＜0.01）。

2.4 CY對T－AOC的影響 由圖4可知，各試驗組L02肝細胞內T－AOC較對照組均有升高，并隨著CY劑量的增加呈現明顯的量效遞增關系。與對照組相比，3組L02肝細胞內T－AOC水平升高顯著（P＜0.05），4組L02肝細胞內 T－AOC水平升高極顯著（P＜0.01）。

3 討論

SOD和GSH－Px是機體內廣泛存在的、重要的催化過氧化氫分解的酶。SOD可調節機體的氧化與抗氧化平衡，其活性高低反映了機體清除氧自由基能力的強弱，在機體抗氧化損傷、抗衰老與免疫調節過程中發揮重要作用［5］。GSH－Px是H2O2防御系統成員，可以清除活細胞內過氧化物，在保護細胞免受自由基損傷的過程中起著關鍵作用。試驗結果表明，CY可以顯著提高模型細胞內SOD和GSHPx水平，因此我們推斷CY可以通過清除脂肪變性細胞內蓄積的過氧化氫，增強細胞抗氧化性。

MDA是不飽和脂肪酸過氧化產物之一。MDA含量可間接反映機體內的脂質過氧化水平，并作為氧化應激的生物標志物，并且和多種疾病的發生、發展有密切關系，是疾病早期嚴重程度的一個重要的標志物［6－7］。特別是在脂肪變性的肝細胞內，其水平保底直接反應細胞的過氧化水平［8］。生物膜中的不飽和脂肪酸易被自由基攻擊而發生過氧化，導致結構和功能發生變化，這些變化勢必影響細胞基本生命活動導致肝細胞功能障礙［9］。本試驗中，CY可降低脂肪變性肝細胞內MDA含量，這表明CY可以通過降低脂質過氧化程度，增強脂肪變性肝細胞的抗氧化能力。

T－AOC代表細胞抗氧化能力的總和，是反應細胞抗氧化能力的重要指標［10］。其強弱與細胞所處狀態有密切聯系，當T－AOC降低時，會引起脂肪變性肝細胞的炎癥反應［11］。本試驗發現，CY能夠顯著提高脂肪變性L02細胞內T－AOC水平，隨著CY計量的增加T－AOC水平逐漸升高，呈現顯著的量效遞增關系。此結果說明L02肝細胞內的各類抗氧化物質合成均得到增強，進而增強L02肝細胞的抗氧化能力。

4 結論

CY可以提高脂肪變性的L02肝細胞內SOD、GSH－Px活性和T－AOC水平，并降低細胞內MDA的含量進而增強L02肝細胞的抗氧化能力，降低脂肪變性所引起的氧化損傷。

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