弓形蟲棒狀體蛋白18的原核表達及鑒定

鞠愛萍，吳亮，沈進，李禮，姜旭淦，陳盛霞

(江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種廣泛分布于世界范圍內的重要的人獸共患寄生蟲，幾乎感染所有的恒溫動物，人類普遍易感，據統計全球約有1/3人口感染弓形蟲［1］。免疫功能正常人群感染弓形蟲后不會出現明顯的臨床癥狀，僅表現為輕度流感樣癥狀，但免疫功能降低、缺陷者或胎兒感染后則可引發嚴重的弓形蟲病，從而導致人體各器官出現嚴重病變，新生兒腦炎、智力障礙，甚至流產、畸胎、死胎［2］。目前弓形蟲感染已成為AIDS患者和器官移植者重要的死亡因素之一［3］。弓形蟲棒狀體蛋白(rhoptry proteins，ROPs)是棒狀體分泌的一系列毒力蛋白，是弓形蟲入侵宿主的重要作用因子［4－5］。近年來，國內外學者對弓形蟲棒狀體蛋白的研究取得了一定進展，證明 ROP18是一個毒力關鍵因子，對于弓形蟲入侵宿主細胞及其在細胞內的生存是十分重要的［6］，而國內對ROP18的研究較少。本研究通過原核表達技術成功構建了原核表達載體并獲得重組ROP18，為深入研究ROP18的生物學功能及其在入侵中發揮的作用提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與蟲株 HeLa細胞購自中國科學院細胞庫。弓形蟲RH株由本室液氮冷凍保存。

1.1.2 實驗動物 家兔，2.0 kg，雄性，購自江蘇省江陵動物實驗中心，清潔級環境下飼養。

1.1.3 菌株與質粒 大腸埃希菌(E.coli)DH5α株和Rosetta株及原核表達質粒pET-28a(+)均由本實驗室保存，pTG19-T載體購自上海捷瑞生物技術有限公司。

1.1.4 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒、2×PCR預混液、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、牛血清白蛋白、DNA標準參照物、異丙基-D-硫代半乳糖苷均購自上海捷瑞生物技術有限公司，限制性核酸內切酶BamH I和HindⅢ購自立陶宛 Fermentas公司，T4連接酶購自寶生物大連有限公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(HRP-IgG)、FITC標記羊抗兔IgG、硝酸纖維素膜NC膜和ECL化學發光檢測試劑盒均購自武漢博士德公司，低聚甲醛、Triton X-100、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑以及4，6-二脒基-2-苯基吲哚均購自美國Sigma公司，其余試劑均為國產分析純。全自動凝膠成像儀及垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司，超聲破碎儀購自北京迪索儀器有限公司，核酸蛋白分析儀購自英國WPA公司，溫控搖床4YC-200購自上海福瑪公司，脫色搖床購自金壇市醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲的培養及總RNA提取 按吳亮等［7］報道的方法在HeLa細胞中傳代培養弓形蟲RH株速殖子。從液氮取出凍存的弓形蟲 RH株，37℃水浴快速復蘇，3 000 r/min離心5 min，用l%胎牛血清RPMI 1640重懸后接種HeLa細胞，置37℃ 5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中進行培養，每天用倒置顯微鏡觀察細胞和蟲體的生長狀態，鏡下觀察到大量蟲體游離于細胞外時收集蟲體，以滅菌PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，按照RNA提取試劑盒說明書抽提弓形蟲速殖子總RNA，經反轉錄為cDNA，－20℃凍存備用。

1.2.2 ROP18基因擴增與克隆 根據ToxoDB基因庫中弓形蟲RH株基因組ROP18基因序列，用DNASTAR軟件設計1對特異性引物。上游引物ROP18-F:5'-GGCGGATCCATGTTTTCGGTACAGCGGCCACCTCTTA-3'(BamHⅠ)，下游引物 ROP18-R:5'-GGCAAGCTTTTATTCTGTGTGGAGATGTTCC TGC TGTTC-3'(HindⅢ)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以弓形蟲cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件:94℃預變性1 min，94℃ 5 s，63.1℃ 90 s，72 ℃ 90 s，25 個循環，72 ℃延伸10 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析正確后，膠回收試劑盒回收 PCR產物，與克隆載體pTG19-T 4℃連接12 h后轉化至感受態 DH5α，涂布于含100 μg/mL氨芐西林、200 μg/mL X-Gal和 100 μg/mL IPTG 的LB瓊脂平板，37℃培養過夜，次日經藍白斑篩選，挑取白色菌落轉入液體LB培養基增菌，按堿裂解法提取重組質粒。

1.2.3 重組質粒ROP18/pTG19-T鑒定 提取的重組質粒經PCR和BamHⅠ酶切鑒定，陽性質粒送上海生工生物工程有限公司測序，基因測序結果經Blast比對分析，與基因庫中弓形蟲ROP18編碼基因完全一致后，用于后續實驗。

1.2.4 ROP18/pET-28a(+)表達載體構建 重組質粒ROP18/pTG19-T和表達質粒pET-28a(+)分別經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后膠回收，經T4連接酶16℃過夜連接后轉化至DH5α感受態細胞，按堿裂解法提取質粒，將重組表達質粒經PCR和雙酶切鑒定，陽性質粒轉入Rosetta感受態細胞。

1.2.5 重組蛋白表達 挑取陽性菌落接種于3 mL含卡那青霉素的LB液體培養基中，37℃，250 r/min振搖培養過夜;次日以1∶100比例接種含同種抗生素的200 mL LB培養基，繼續培養約2 h，直至光密度(D)值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，30℃ 250 r/min誘導培養6 h，收集菌體，洗滌后加入包涵體結合緩沖液，充分重懸菌體，靜置30 min后超聲裂解菌體，4℃ 15 000 r/min離心30 min，收集上清液。

1.2.6 重組蛋白純化 根據目的蛋白相對分子質量大小配制分離膠，不插樣品梳直接上樣，SDSPAGE電泳參照文獻［8］進行，直到溴酚藍染料抵達分離膠底部時結束電泳。將膠塊取下置于預冷KCl(250 mmol/L)溶液中，振搖染色10 min，膠塊上可呈現一條白色的目的蛋白條帶，將此條帶切下置于PBS緩沖液中振搖洗滌5 min。根據后續實驗需要進一步處理膠條:用于制備多克隆抗體時，將膠條與適量佐劑混合后于冰上充分研磨粉碎，形成“油包水”狀即可免疫家兔;ELISA實驗包被抗原時，將膠條置于EP管中，加入少許PBS緩沖液振蕩混勻，－20℃反復凍溶3次，4℃ 16 400 r/min離心15 min，取上清液即為ELISA實驗的包被抗原。

1.2.7 兔抗重組蛋白ROP18多克隆抗體制備 按姜旭淦等［9］報道方法進行。制備足量乳化抗原，經背部皮內多點注射法免疫家兔，初次免疫前采集兔耳緣靜脈血液，取血清作陰性對照，第1次免疫3周后，進行第2次免疫，間隔1周進行第3次加強免疫，共免疫3次，劑量及免疫途徑同首次免疫。加強免疫1周后經耳緣靜脈采集兔血，分離血清，以ELISA法檢測其血清抗體效價，當抗體效價＞1∶51 200時，即可采用心臟采血法收集兔血，分離血清，此即兔多克隆抗體，分裝后于－70℃保存備用。

1.2.8 蛋白質印跡檢測ROP18在弓形蟲速殖子中的表達 HeLa細胞中傳代培養弓形蟲RH株速殖子，收集1×107蟲體于EP管中，加SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混勻后煮沸10 min，4℃ 16 400 r/min離心20 min，取上清液上樣進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將目的蛋白轉印至NC膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000兔抗ROP18抗血清，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次后，與1∶5 000 HRP標記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，充分洗滌后進行ECL顯影反應，化學發光儀觀察結果。

1.2.9 間接免疫熒光(IFA)觀察ROP18在弓形蟲速殖子中的分布 在6孔細胞培養板內放置1塊干凈蓋玻片，無菌操作接種 2.5×105個/孔HeLa細胞，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養。鏡下觀察細胞生長融合至80%時，接種弓形蟲速殖子1×106個/孔，繼續置于37℃ 5%CO2培養箱中培養，共培養至4 h時取出蓋玻片，以PBS緩沖液振搖洗滌3次，4%低聚甲醛室溫固定15 min，經0.25%Triton X-100透化處理15 min后，5%BSA室溫封閉1 h，滴加兔抗ROP18抗血清(1∶1 000)37℃孵育2 h，PBS緩沖液振搖洗滌3次，加FITC-IgG(1∶100)37℃孵育1 h，洗滌3次后加入適當濃度的DAPI溶液復染，洗滌后以抗熒光淬滅封片劑封片，立即置于熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 弓形蟲ROP18基因體外擴增結果

以弓形蟲 cDNA為模板，PCR擴增弓形蟲ROP18基因，其擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小約1 665 bp(圖1)，與弓形蟲ROP18基因理論擴增片段大小相符。

圖1 PCR擴增弓形蟲ROP18基因結果Fig 1 Amplification of ROP18 gene in T.gondii by PCR

2.2 ROP18/pET-28a(+)重組質粒的鑒定

重組質粒ROP18/pET-28a(+)經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到約1 665 bp和5 369 bp片段，與預期結果一致(圖2)，證明ROP18基因被完整插入表達載體pET-28a(+)中。

圖2 ROP18/pET28a(+)重組質粒雙酶切鑒定結果Fig 2 Identification of ROP18/pET28a(+)by restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白ROP18表達純化

重組蛋白主要以包涵體形式存在，經 KCl染色(圖3)，可見相對分子質量67×103處有目的蛋白表達帶，與ROP18蛋白理論預測值大小一致。采用切膠法純化蛋白，將目的蛋白條帶切下，經SDSPAGE電泳檢測分析，可見67×103處一條目的蛋白回收帶 (圖4)，此即為純化的目的蛋白。

2.4 弓形蟲速殖子ROP18的表達

經蛋白質印跡檢測發現，免疫兔血清能識別相對分子質量為 55×103的反應條帶(圖 5)，與ROP18相對分子質量值相符，表明采用KCl染色切膠法純化蛋白方法可行，并且制備的兔多克隆抗體特異性較好。

2.5 弓形蟲速殖子ROP18的分布

熒光顯微鏡下觀察到ROP18蛋白的綠色熒光分布于弓形蟲速殖子細胞核前端，與棒狀體位置一致，與細胞核藍色熒光不重合，A、B融合圖可以清楚地定位ROP18蛋白在蟲體內的分布(圖 6)。

圖3 重組ROP18蛋白KCl染色Fig 3 Recombinant ROP18 by KCl stain

圖4 重組ROP18蛋白純化結果SDS-PAGE分析Fig 4 Purification of recombinant ROP18 by SDS-PAGE analysis

圖5 蛋白質印跡法檢測弓形蟲速殖子ROP18表達Fig 5 Western blotting analysis of ROP18 expression in T.gondii

圖6 IFA檢測弓形蟲速殖子ROP18蛋白表達(×1 000)Fig 6 ROP18 expression in T.gondii tachyzoites by IFA

3 討論

弓形蟲ROP18是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有激酶活性，是弓形蟲的關鍵毒力因子［10－11］。對ROP18進行序列分析發現，它和ROP2家族中的另一成員ROP5最接近，有28%的同源性，和ROP2有25%的同源性［6］，在RH株蟲體中可以大量表達，相對分子質量約為55×103。已有研究發現，ROP18定位于弓形蟲納蟲泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)［12］，宿主體內 γ 干擾素可誘導機體產生免疫相關GTP酶(IRGs)因子，其中IRG6因子可自動聚積于PVM上，造成PVM損害，使蟲體失去保護膜，從而使得機體免疫系統殺死PVM中的蟲體［13］。而ROP18可與IRG6結合，使其磷酸化而喪失活性，不能聚積于PVM上，無法破壞弓形蟲周圍的保護膜，從而使蟲體逃避宿主免疫系統的清除，保護PVM中蟲體存活并正常生長繁殖［14］。

本研究采用原核表達系統，成功獲得了重組弓形蟲ROP18，經純化后免疫家兔，制備了抗ROP18多克隆抗體;采用IFA和蛋白質印跡技術檢測了ROP18在蟲體中的分布和表達，為進一步研究ROP18在弓形蟲入侵及生長繁殖中的作用提供了技術支撐。

本研究中對于表達的包涵體蛋白純化方法，起初使用常規的Ni-NTA親和層析法，但出現目的蛋白與Ni-NTA層析柱不結合的情況，造成目的蛋白的大量丟失，不能很好地純化目的蛋白。本研究通過KCl染色切膠法純化蛋白，獲得了高濃度的目的蛋白，并成功免疫家兔，制備了相應的抗ROP18多克隆抗體，經ELISA技術檢測證實此抗體具有較高的滴度;應用蛋白質印跡技術可以驗證在55×103處有特異性條帶。以上結果表明，通過KCl染色切膠法回收的ROP18蛋白仍保留天然蛋白的一級結構，從而保持了ROP18蛋白的抗原性。與傳統的純化包涵體蛋白方法相比，KCl染色切膠純化法具有以下優點，①簡單易行:實驗步驟簡單，避免了多次洗脫親和層析柱的繁瑣工作;② 經濟實用:所用試劑數量少且普通，易得便宜，降低了實驗成本;③快速省時:實驗時間明顯縮短，節省了實驗時間。但不適用于純化表達量較低的蛋白。KCl染色切膠免疫方法的應用為包涵體形式存在蛋白的多克隆抗體制備提供了一種便利方法，所分離的蛋白純度高、量大，不僅為進一步研究蛋白的結構和生物學分析提供了技術支持;而且在乳化抗原中可以緩慢釋放抗原，有效發揮免疫佐劑的作用［15－16］。有研究已證實切膠免疫還能滿足單克隆抗體制備的要求［17－18］。因此，KCl染色切膠回收蛋白是一種可行的方案，值得應用推廣。

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