S100B在多柔比星誘導心肌細胞損傷中的表達及作用

韓堯輝，潘皓，毛俊倩，周艷芳，張贏予，王好，鮑永輝，趙龍，劉玲玲，張國輝

(江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002)

多柔比星(doxorubicin，DOX)是一種廣譜抗腫瘤藥物，長期應用可引起心臟毒性，進而引起不可逆轉的心肌損傷和心功能障礙［1］。研究表明多柔比星引起的心臟毒性與心肌細胞的凋亡密切相關。S100B作為一種多功能鈣敏感蛋白，在生理條件下，心肌細胞幾乎不表達。有研究表明S100B可以直接引起心肌細胞凋亡［2］。本實驗通過建立多柔比星損傷心肌細胞模型，研究S100B在心肌細胞損傷時的表達變化;通過RNA干擾技術沉默S100B基因，研究S100B在多柔比星誘導心肌細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1日齡新生SD大鼠，雌雄不限，由江蘇大學實驗動物中心提供。S100B siRNA:上游序列5'-CCGGGAACUAUUGAUAAGATT-3'，下游序列 5'-UCUUAUCAAUAGUUCCCGGTT-3';陰性對照siRNA:上游序列5'-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游序列5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'皆由上海吉瑪公司合成。脂質體RNAi-MAX購自美國Invitrogen公司。鹽酸多柔比星購自美國Enzo公司，DMEMF-12培養基、MTT均購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，多聚賴氨酸、RIPA裂解液(強)、PMSF均購自碧云天生物科技公司，α-橫紋肌肌動蛋白(αsarcomericactin，α-SA)、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自南京厚載生物科技有限公司，S100B(D10G6)兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling，單克隆β-肌動蛋白購自北京四正柏生物科技有限公司，山羊抗兔、抗小鼠IgG、免疫印跡高靈敏度化學發光檢測試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司。其余生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞原代培養 取出生1 d的SD乳鼠，75%的乙醇消毒2次，無菌條件下開胸取出心臟，置于預冷的PBS中吹打清洗2次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入5倍體積0.08%的胰酶于37℃水浴箱振蕩消化5 min，收集除第1次外的細胞懸液，置于含20%胎牛血清的DMEMF-12培養基中終止消化。重復上述過程，直至組織塊完全消化，最后離心、重懸、200目濾網過濾、接種，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養1.5 h，純化心肌細胞。按密度為1×106接種在6孔板中，孵育箱中靜置培養，待用。

1.2.2 心肌細胞形態學觀察及鑒定 于倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態學變化及搏動情況并拍照;培養72 h的心肌細胞，PBS清洗3次，4%的低聚甲醛固定后，用α-SA做免疫組化進行純度鑒定，鏡下隨機取20個視野，每個視野20個細胞，計算心肌細胞比例。

1.2.3 分組及轉染 體外分離培養心肌細胞，選取生長狀態好的隨機分為4組:對照組為正常心肌細胞，不做任何處理;DOX組:加入2 μmol/L多柔比星處理2 h;DNC組:轉染陰性siRNA，加入多柔比星(2 μmol/L)處理2 h;DSB組:轉染特異性 S100B-siRNA，加入多柔比星(2 μmol/L)處理 2 h。按照Invitrogen脂質體RNAi-MAX說明，轉染前24 h換用無血清DMEMF-12培養基，于細胞融合度為80%時進行轉染。取100 μL DMEMF-12稀釋5 μL siRNA，輕輕混勻，100 μL DMEMF-12 與6 μL 的脂質體RNAi-MAX輕輕混勻，最后將兩者混合物等體積混勻，輕柔吹打幾次，室溫孵育15 min。將200 μL的混合液呈滴狀滴加在6孔板中，混勻。最終siRNA濃度為100 nmol/L。置37℃、5%CO2孵箱中培養24 h后，換含有10%胎牛血清的DMEMF-12培養基繼續培養24 h，棄掉培養液，DOX組、DNC組和DSB組分別加入終濃度為2 μmol/L的多柔比星處理2 h。

1.2.4 MTT檢測細胞存活率 心肌細胞按1×105接種于96孔板中，待細胞融合度達80%時，按上述方法進行轉染，以不做任何處理的心肌細胞作為對照組，每組設4個復孔，空白孔調零。每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃ 孵育 4 h，棄每孔上清，加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀(490 nm)檢測各孔光密度(D)值。心肌細胞存活率=(處理組D值-空白孔D值)/(對照組D值-空白孔D值)×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測凋亡率 將處理后的心肌細胞用胰酶消化、離心收集。預冷的PBS洗滌細胞2次，結合緩沖液重新懸浮細胞，調整密度為1×106/mL;取100 μL的細胞懸液加入5 μL的Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光孵育15 min;再加10 μL PI輕輕混勻于4℃避光孵育5 min;最后加入300 μL的結合緩沖液，在1 h內流式細胞儀檢測，以百分數表示凋亡率。

1.2.6 蛋白質印跡檢測S100B蛋白 處理后的心肌細胞用預冷的PBS清洗3次，細胞刮刮取細胞，4℃，5 000 r/min，離心5 min，收集細胞團，加入RIPA裂解液(含 PMSF)冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，收集上清液即為總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100℃變性5 min，上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣約為40 μg，電泳結束后將蛋白印跡到硝酸纖維膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，最后ECL顯影。采用Image-proplus軟件分析蛋白條帶D值，以靶蛋白D值與β-肌動蛋白D值的比值反應靶蛋白相對水平。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理和分析，計量資料以±s表示，多組數據比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞形態學觀察及純度鑒定

剛分離的心肌細胞呈球形，培養4 h細胞開始貼壁生長，逐漸由圓形變為梭形，并開始伸出偽足，后變為三角形、多邊形等。培養72 h后細胞伸出偽足相互交織成網，逐漸形成細胞簇或細胞單層，搏動呈同步性，搏動頻率為65～150次/min，見圖1。培養72 h的心肌細胞進行α-SA鑒定，細胞質呈棕黃色即為陽性，結果顯示心肌細胞純度可達90%。見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察培養后的心肌細胞(×200)Fig 1 Cultured cardiomyocytes isolated from 1d SD rats

圖2 α-SA免疫化學染色鑒定原代心肌細胞純度(×400)Fig 2 Purity of cardiomyocytes evaluated by immunocytochemical staining with α-SA

2.2 各組心肌細胞存活率比較

MTT檢測結果表明，DNC組心肌細胞存活率與DOX組相比差異無統計學意義(P＞0.05);與DOX組相比，DSB組存活率上升，差異有統計學意義(t=2.48，P ＜0.05)。見表1。

2.3 各組心肌細胞凋亡率比較

流式細胞術分析表明，DNC組心肌細胞凋亡率與DOX組比較，差異無統計學意義(P＞0.05);與DOX組相比，DSB組凋亡率降低(t=0.76，P＜0.01)，差異有統計學意義。見圖3，表1。

2.4 各組心肌細胞S100B蛋白表達

蛋白質印跡法檢測S100B蛋白表達結果顯示，DNC組與DOX組相比差異無統計學意義(P＞0.05);與DOX組相比，DSB組蛋白表達明顯降低(t=1.82，P ＜0.01)。見圖4，5。

圖3 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率Fig 3 Apoptosis rate determined by flow cytometry

表1 各組心肌細胞存活率和凋亡率Tab 1 Survival rate and apoptosis rate of cardiomyocytes from different groups

圖4 蛋白質印跡檢測心肌細胞S100B蛋白表達Fig 4 The results of S100B protein expression evaluated by Western blotting

圖5 各組心肌細胞S100B表達比較Fig 5 S100B protein expression in different groups

3 討論

多柔比星是一種蒽環類抗腫瘤抗生素，廣泛應用于多種腫瘤性疾病的治療，由于該藥存在心臟毒性并呈現劑量依賴性［3］，從而限制了其臨床應用。目前，對于多柔比星心臟毒性的機制仍不明確，普遍認為，活性氧自由基、線粒體損傷、鈣超載、脂質過氧化、心肌細胞凋亡為其重要環節，隨著進一步的研究，多柔比星導致的心肌細胞凋亡成為新的研究熱點［4］。研究發現，心肌細胞的凋亡是多柔比星心臟毒性最為直接的表現形式之一［5］。多柔比星誘導的心肌細胞凋亡的具體機制目前主要集中在Fas/FasL途徑、線粒體途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、p53途徑等。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是由基因控制的細胞主動死亡形式。細胞外部的因素，可通過影響這些基因的表達，實現對凋亡的調控。在多柔比星引起的心臟毒性中，細胞凋亡發揮著極為重要的作用，光鏡下觀察發現，多柔比星處理過的心肌組織存在著大量凋亡的細胞。S100B是S100蛋白家族的一員，是一種新型的鈣敏感結合蛋白，在正常的心肌細胞中不表達［6］。近幾年通過轉基因技術研究發現，S100B的過度表達能夠引起心肌細胞凋亡，導致心梗小鼠梗死面積擴大［2］。在培養的心肌細胞中，加入外源性的S100B可以引起心肌細胞凋亡，并呈劑量依賴性，起始劑量為 100 nmol/L［7］。S100B有可能是與晚期糖基化終末產物受體(RAGE)相互作用進而激活 ERK1/2和 p53［7］，導致細胞色素C釋放以及激活了預凋亡胱天蛋白酶級聯反應(已經在N18神經母細胞瘤細胞中證實)［8］，從而引起心肌細胞凋亡。此外，在細胞內S100B也有可能通過激活誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和產生一氧化氮(NO)，從而調節心肌細胞凋亡［9］，這一現象已經在星形細胞中證實［10］。

本實驗建立多柔比星損傷模型，觀察S100B蛋白的表達變化及其作用。結果表明，S100B在正常心肌細胞中不表達，多柔比星誘導凋亡的心肌細胞中表達明顯增加;多柔比星干預后的心肌細胞存活率降低，凋亡率升高。用脂質體RNAi-MAX轉染試劑介導化學合成的siRNA轉染原代大鼠心肌細胞后，與DOX組相比，DSB組心肌細胞凋亡率降低，S100B蛋白表達明顯受到抑制。這說明S100B在多柔比星誘導心肌細胞凋亡中起促進作用。

綜上所述，S100B可能是多柔比星誘導心肌細胞凋亡的重要途徑之一，可作為對多柔比星心臟毒性進一步探索的靶點。

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