基于口服免疫耐受原理的人腫瘤小鼠荷瘤模型的建立

劉霞，成靜，范興文，周小兵，周丹，吳衛疆，華曄，邵啟祥

(1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013;2.江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇鎮江212001;3.江蘇大學附屬醫院腫瘤科，江蘇鎮江212001)

腫瘤的發病原因和發生機制尚不完全清楚。因此，建立人類腫瘤的動物模型對研究腫瘤的發生機制和防治措施具有十分重要的意義。目前，腫瘤的動物模型大多是采用裸鼠、嚴重聯合免疫缺陷(SCID)等動物接種人類腫瘤細胞系而建立的;此外，通過給動物局部注射化學致癌劑也可誘發腫瘤。這兩種動物模型都有一定的缺點，首先，兩者均不符合腫瘤自然發生的模式。其次，前者的實驗動物價格昂貴，飼養環境要求高，易發生感染，影響實驗結果;后者接受的化學致癌劑的劑量在自然環境中幾乎是不可能的，其誘導的腫瘤類型比較單一，而且大量致癌劑的使用會造成環境污染。此外，還有一些采用基因修飾的腫瘤模型，與自然發生的腫瘤相差更遠［1-2］。本研究擬利用口服免疫耐受的原理，建立一種簡便、經濟的特異性人肝癌小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細胞系(江蘇大學藥學院高靜教授惠贈)和人卵巢癌3AO細胞系 (上海市腫瘤研究所覃文新研究員惠贈)，用100 mL/L小牛血清DMEM培養液自行傳代培養。90只清潔級昆明種小鼠、6～8周齡，由江蘇大學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證:SCXK(蘇)2009-0002;實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2008-0024。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將90只小鼠按隨機數字表法分為空白對照組、無關腫瘤對照組和腫瘤模型組，每組30只。

1.2.2 基于口服免疫耐受的人腫瘤小鼠模型的建立

腫瘤模型組:小鼠以人肝癌HepG2細胞系(2×106個細胞/d)灌胃，連續7 d;無關腫瘤對照組:以同樣數量的人卵巢3AO細胞系連續灌胃7 d;空白對照組以等體積的生理鹽水連續灌胃7 d。然后，3組小鼠均于背部皮下接種HepG2細胞2×106/L。觀察并記錄腫瘤出現時間、腫瘤體積、腫瘤濕重、腫瘤生長速度、小鼠體質量及生活習性的改變等。腫瘤的大小以游標卡尺每三天測量1次。按照文獻［3］，采用公式V=ab2/2(V=腫瘤體積，a=瘤體最長徑，b=瘤體最短徑)計算腫瘤體積。

1.2.3 腫瘤組織的病理學檢查 于腫瘤細胞接種后不同時間處死小鼠，剝離瘤體，去除四周脂肪組織，稱量腫瘤的重量，然后依次經100 g/L甲醛溶液固定、常規脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 腫瘤模型的建立

腫瘤模型組小鼠以HepG2細胞灌胃7 d后，皮下接種HepG2細胞的致瘤率達90%(27/30)，平均潛伏期為10 d(圖1)。無關腫瘤對照組和空白對照組灌胃7 d后皮下接種HepG2細胞，均未見腫瘤形成(圖2)。

圖1 注射肝癌細胞后的腫瘤形成率Fig 1 Incidence of tumor formation after cells injection

圖2 3組小鼠形成的腫瘤外觀Fig 2 Appearance changes of tumor formation in three groups

2.2 腫瘤的生長特點

腫瘤模型組小鼠皮下注射HepG2細胞后7～10 d，注射部位可觸及實質性包塊，在接種后12～20 d時，處于快速生長期(圖3)。隨著腫瘤的生長，腫瘤的濕重不斷增加，但到后期(20 d后)，由于腫瘤發生壞死，腫瘤體積增長緩慢，甚至縮小(表1)。初期腫瘤表面一般有被膜，在晚期因腫瘤向深層肌肉浸潤而無明顯界限;腫瘤組織與皮膚黏連，皮膚可發生破潰或壞死，出現結痂(圖2F)。

圖3 注射HepG2細胞后小鼠體內腫瘤生長速度Fig 3 The growth rate of HepG2 cells in mice

表1 接種HepG2細胞后不同時間腫瘤濕重、小鼠體質量以及兩者之比的關系Tab 1 The relationship between tumor weight，body weight and the ratio at different time after HepG2 cells injection

2.3 腫瘤組織的病理學檢查

經HE染色后于顯微鏡下觀察，在毛細血管周圍，腫瘤細胞呈團狀(癌巢)或呈散在分布。腫瘤細胞的核較大，形態不一，核深染，核膜增厚，染色質增多且分布不均勻。無關腫瘤對照組和空白對照組小鼠接種1周后接種處組織病理切片顯示仍有殘存的腫瘤細胞;接種2周后腫瘤細胞幾乎被小鼠機體的免疫系統清除，局部有大量浸潤的淋巴細胞與中性粒細胞，以及少數呈空泡狀的腫瘤細胞。見圖4。

圖4 各組小鼠腫瘤組織病理形態(HE染色×400)Fig 4 Pathological changes of tumor tissues in different groups

3 討論

口服耐受是指口服某種抗原后，誘導局部腸相關淋巴組織(gut associated lymphoid tissues，GALT)的特異性免疫，從而抑制全身對該抗原的特異性免疫應答，但機體對其他抗原仍可產生正常的免疫性應答［4］。抗原口服后，首先接觸到的是GALT中的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)。DCs捕獲抗原，處理后提呈給局部的T細胞，并誘導其分化為調節性 T細胞(regulatory T cells，Treg細胞)，Treg細胞可誘導機體對相應抗原產生全身性免疫耐受［2，5］。根據這一原理，我們假設通過口服免疫耐受途徑可誘導腫瘤抗原對相應的腫瘤細胞產生免疫耐受。本實驗給予小鼠較高劑量的人肝癌HepG2細胞系(2×106/L)連續灌胃7 d，試圖誘導小鼠對HepG2細胞產生特異性免疫耐受，然后再于背部皮下接種HepG2細胞。結果顯示，經HepG2細胞灌胃的小鼠對接種的HepG2細胞不產生免疫排斥反應，并可在其體內生長形成腫瘤結節;采用人卵巢癌3AO細胞系灌胃的小鼠對接種的HepG2細胞無容受性，不能在小鼠體內生長形成腫瘤。上述結果表明，通過口服免疫可誘導出相應腫瘤細胞的特異性免疫耐受。基于口服免疫耐受的原理，建立腫瘤動物模型尚未見類似的報道。

口服抗原誘導抗原特異性免疫耐受的方法，現已廣泛應用于自身免疫性疾病、食物過敏及器官移植等疾病的治療研究［6-8］。例如，口服胰島來源的自身抗原治療1型糖尿病［9］;口服糖基化雞2型膠原(UC-2，10 mg/d)治療類風濕關節炎(女性患者)［10］;口服塵螨抗原治療過敏反應［11］;口服牛Ⅱ型膠原(CⅡ)治療幼年性類風濕關節炎［12］;口服耐受抑制實驗性卵巢早衰抗透明帶抗體的產生［13］;口服同源脊髓勻漿誘導昆明鼠耐受，治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎［14］等。

本研究基于口服免疫耐受的機制建立的人腫瘤動物荷瘤模型，比較符合自然過程發生的腫瘤，且可以較好地模擬腫瘤的病理過程，便于腫瘤發生機制和防治的研究。此外，該模型的制備操作簡便，成瘤率高，成本較裸鼠和SCID小鼠低，便于推廣。

［1］ Liu J，Johnston MR.Experimental animal models for studying lung cancer and evaluating novel intervention strategies［M］∥Keshamouni V，Arenberg D，Kalemkerian G.Lung cancer metastasis:novel biological mechanisms and impact on clinical practice.New York:Springer，2009:241-265.

［2］ Park KS，Park MJ，Cho ML，et al.TypeⅡ collagen oral tolerance;mechanism and role in collagen-induced arthritis and rheumatoid arthritis［J］.Mod Rheumatol，2009，19(6):581-589.

［3］ 張煜，徐涵文，張太平，等.注射法制作ICR小鼠肝癌模型及其改進［J］.細胞生物學雜志，2007，29(3):434-438.

［4］ 解德瓊，甘華，杜小剛.口服免疫耐受研究進展［J］.國外醫學:泌尿系統分冊，2005，25(1):111-114.

［5］ Spiekermann GM，Walker WA.Oral tolerance and its role in clinical disease［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr，2001，32(3):237-255.

［6］ Castro-Sánchez P，Martín-Villa JM.Gut immune system and oral tolerance［J］.Br J Nutr，2013，109(Suppl 2):3-11.

［7］ Ishida W，Fukuda K，Harada Y，et al.Oral administration of Ag suppresses Ag-induced allergic conjunctivitis in mice:critical timing and dose of Ag［J］.Br J Ophthalmol，2013，97(4):492-497.

［8］ Birmingham JM，Patil S，Li XM，et al.The effect of oral tolerance on the allergic airway response in younger and aged mice［J］.J Asthma，2013，50(2):122-132.

［9］ Martinez NR，Augstein P，Moustakas AK，et al.Disabling an integral CTL epitope allows suppression of autoimmune diabetes by intranasal proinsulin peptide［J］.J Clin Invest，2003，111(9):1365-1371.

［10］ Bagchi D，Misner B，Bagchi M，et al.Effects of orally administered undenatured typeⅡcollagen against arthritic inflammatory diseases:a mechanistic exploration［J］.Int J Clin Pharmacol Res，2002，22(3/4):101-110.

［11］ Sato MN，Carvalho AF，Silva AO，et al.Oral tolerance induced to house dust mite extract in naive and sensitized mice:evaluation of immunoglobulin G anti-immunoglobulin E autoantibodies and lgG-IgE complexes［J］.Immunology，1998，95(2):193-199.

［12］ Myers LK，Higgins GC，Finkel TH，et al.Juvenile arthritis and autoimmunity to typeⅡ collagen［J］.Arthritis Rheum，2001，44(8):1775-1781.

［13］ 付莉，黃冰玉，趙怡璇，等.口服耐受對實驗性卵巢早衰抗透明帶抗體的抑制作用研究［J］.現代婦產科進展，2006，15(9):681-683.

［14］ 鮑健，胡學強.經消化道誘導昆明鼠耐受實驗性自身免疫性腦脊髓炎［J］.中國免疫學雜志，2005，21(3):224-225.