結直腸癌轉移復發的轉化醫學研究

鄭樹

轉化醫學研究的過程是以患者為中心、以臨床問題為導向、以成果應用為目標而進行的基礎研究，是多層次、多學科交叉融合的系統研究工程［1］。近十余年來，結直腸癌基礎研究及臨床診治方面有了很大進展，但其總生存率仍有待提高。轉移復發是腫瘤治療失敗最主要原因，并直接影響預后。結直腸癌轉移復發決定于腫瘤本身的生物學特征，包括病理類型和分期等。然而，同一形態、類型或分期的患者經同一治療方案治療后往往效果迥異，預后不一。如能夠結合分子水平的分類、分型或分期將更精準的體現其客觀生物學特征。如何對結直腸癌進行精準的分子分型是當前結直腸癌在轉化醫學研究所面臨的重要問題，也是判斷或預測轉移復發及預后相關分子事件研究的重要方面。研究結直腸癌轉移復發相關分子事件包括上皮間質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)及間質上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)的系統研究。以結直腸癌轉移復發預測為目標的轉化醫學研究基本過程歸納如下:

一、發掘(discovery)

首先是發現或發掘相關標志物。可根據不同臨床病理表型的組織樣本，如有肝轉移及無肝轉移的結直腸癌原發灶，對比二者基因表達譜中存在明顯差異的基因。此類研究如，經基因表達譜芯片篩選［1］在有轉移的原發灶發現高表達的骨橋蛋白(osteopontin)及顯著低表達的Spacr L1，這兩個基因在表達量上顯然與轉移浸潤相關，可能為結直腸癌肝轉移的標志物，這兩個基因必然與預后相關。

二、鑒定(identification)

第二步需證明發現的基因在結直腸癌細胞中存在、表達程度和相關功能，包括高不同表達水平對EMT-MET相關變化的影響，包括細胞增殖、生長曲線、細胞周期、細胞凋亡以及與轉移相關的遷移、浸潤等。明確基因的功能，同時在動物實驗模型中鑒定研究該基因表達對小鼠移植瘤轉移的影響。

三、證實(verification)

發現及鑒定的基因在臨床是否可預測腫瘤的轉移、復發和預后，或是否可作為干預阻斷的候選靶點，這些需要進一步證實。為此，要應用一定數量的人體樣本或病理組織臘塊標本，并結合臨床病理信息，包括治療后的隨訪資料。分析該基因與生存率和復發率的相關性，進而證實其對臨床預測的意義。

四、確認(validation)

該基因作為結直腸癌轉移復發標志物的臨床應用可行性、實用價值與實際意義需要進一步確認。為此，應開展多中心大樣本試驗。以同一方法檢測分析，以驗證及確認該標志物的意義，進而可推廣應用。

轉化醫學研究源于臨床需求，亦回饋服務于臨床，是基礎與臨床緊密結合的系統工程。轉化醫學研究不僅需具備基礎研究的可靠技術手段和實驗設備，以準確提供精確反映腫瘤生物特征與功能的分子表型的結果，同時要求規范的臨床病理診斷，不可或缺的生物組織樣本庫，規范的長期患者隨訪資料，以及高質量研究機構間的多中心合作，這樣結論才會具有臨床指導價值。

現列舉以下已發表的幾組資料供同道們參考:

1．SPARCL1基因:該基因是細胞外基質中的一種糖蛋白，與細胞粘附增殖有關。在很多正常組織中有較高表達。Hu等［2］從有、無肝轉移的兩組結直腸癌原發灶基因表達譜中篩選出有明顯差異的基因，發現SPARCL1基因在無肝轉移的結直腸癌原發灶中明顯高表達，而在有肝轉移的結直腸癌中明顯表達低。作者經qRT-PCR和人體樣本免疫組化鑒定均確定無轉移原發灶表達明顯高于有轉移的結直腸癌(P＜0．05)，在腫瘤分化差結直腸癌蛋白表達低或無，在腫瘤分化好的結直腸癌蛋白表達明顯較高。經功能研究，明確了SPARCL1抑制腸癌RKO細胞的侵襲、移動及穿透能力，小鼠體內試驗證實該基因抑制體內成瘤及肝轉移(P＜0．009)。從基因表達水平(qRT-PCR)及蛋白水平(western blot)均發現與EMT相關。SPARCL1表達增高與E-cadherin表達增高、Vimentin及N-cadherin表達降低明顯相關。RKO及SW620細胞轉染高表達SPARCL1或加入該蛋白，均可見細胞有EMT和MET腺管樣形態(圖1)。SPARCL1基因功能鑒定后，虞舒靜等［3］分析了1999年至2004年隨訪36個月的156例大腸癌組織標本，以免疫組織化學法檢測SPARCL1表達水平。將從低到高表達水平依次設為0～3，發現高表達SPARCL1的結直腸癌患者的生存率明顯高于低表達患者(P=0．043)(圖2)，從臨床單中心病例證實了該基因可做為預測結直腸癌患者預后的標志物，但仍需進一步確認。2011年，中美兩大癌癥研究中心對SPARCL1基因進行了雙中心大樣本對比分析。兩組對比分別從各自生物樣本庫(浙江大學腫瘤研究所412例，美國希望城醫學中心222例)取結直腸癌樣本進行確認。分析結果確認SPARCL1基因表達高者預后較好(圖3)。

圖1 SW620及RKO細胞轉入SPARCL1或培養液中加入該蛋白的光鏡下觀察圖像，顯示細胞排列呈腺管樣形態(MET ×10)

圖2 免疫組織化學檢測SPARCL1蛋白表達強度分層分析，顯示SPARCL1蛋白高表達者生存率明顯高于低表達者。

2．SOX2基因:該基因是一個重要的干細胞標志物，與腫瘤的發生發展極為相關，但與腫瘤轉移、浸潤以及在EMT-MET轉化中的作用尚無人報道。Han等［4］進行了體內外研究，敲除結直腸癌SW620細胞的SOX2基因，結果發現SW620細胞由EMT轉向MET，細胞轉移浸潤功能明顯減弱。作者為證實SOX2基因表達在結直腸癌中的意義，對44例結直腸癌組織石臘標本進行免疫組化(IHC)檢測，以觀察SOX2蛋白表達。結果發現44例結直腸癌中陽性表達者有9例，其中7例有肝轉移(77．8%)，8例淋巴結轉移(88．8%)。而 SOX2陰性者分別為40．0%(14/35，P=0．029)及 51．4%(18/35，P=0．039)。從分期看，T1～2期腫瘤患者，SOX2表達均為陰性。9例SOX2表達陽性者均為T3～4(P=0．0006)。說明從對臨床樣本的研究中也體現SOX2與轉移浸潤相關。從預測預后的分子標志物角度看，SOX2基因研究尚缺乏足夠的具有完整隨訪生存率病例的證實與確認，但該發現說明了SOX2與轉移浸潤相關并具有促EMT的作用，這為做進一步證實與確認提供了基礎。

圖3 兩組生物樣本庫SPARCL1表達與相關因素分析情況

MGA2基因 該基因為核苷酸還原酶小亞基M2，其過度表達會促進腫瘤增殖及浸潤。經美國希望城醫學中心217例腸癌患者及浙江大學腫瘤研究所220例腸癌患者驗證［5］，證實高表達者在兩大組中總生存期和無病生存期均明顯降低，其相對危險度在希望城組和浙江大學組分別為1．88和2．06。多因素分析提示錯配修復基因缺失者風險度明顯增加，如在希望城組達12．2。顯然，HMGA2基因是預測預后的獨立因素。

總之，結直腸癌轉移復發的轉化醫學研究最終是為臨床服務，目標在于解決臨床需要。規范樣本的取用和檢測，開展多中心協作，在大數量的標本中確認與臨床的關系，這些是必須的。我國人口眾多，人群生物組織樣本資源較為豐富，但需注意收集與保存。臨床標本的合理利用應引起足夠的關注與重視。

［1］ 鄭樹，黃彥欽，董琦，等．結直腸癌的轉化醫學研究．中華胃腸外科雜志，2013，16(1):4-7．

［2］ Hu H，Zhang H，Ge W，et al．Secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1 suppresses aggressiveness and predicts better survival in colorectal cancers．Clin Cancer Res，2012，18(19):5438-5448．

［3］ Yu SJ，Yu JK，Ge WT，et al．SPARCL1，Shp2，MSH2，E-cadherin，p53，ADCY-2 and MAPK are prognosis-related in colorectal cancer．World J Gastroentero，2011，17(15):2028-2036．

［4］ Han X，Fang X，Lou X，et al．Silencing SOX2 induced mesenchymal-epithelial transition and its expression predicts liver and lymph node metastasis of CRC patients．PLoS One，2012，7(8):e41335．

［5］ Wang X，Liu X，Li AY，et al．Overexpression of HMGA2 promotes metastasis and impacts survival of colorectal cancers．Clin Cancer Res，2011，17(8):2570-2580．

鄭樹．結直腸癌轉移復發的轉化醫學研究［J/CD］．中華結直腸疾病電子雜志，2013，2(1):2-5．