豬牙皂正丁醇提取物含藥血清抑制人肝癌細胞SMMC-7721的實驗研究*

汪紅衛 張赤志 許漢林 陳 成 蔡 岳 王曉東

1.湖北中醫藥大學2010級博士生部 (湖北武漢，430061) 2.湖北省中醫院 3.湖北中醫藥大學藥學院 4.湖北中醫藥大學2012級博士生部

原發性肝癌是一種全球性高度惡性的腫瘤［1］，病機十分復雜。中醫對其治療有許多探討，從痰論治原發性肝癌［2］是主要方法之一，涉及多味化痰中藥［3，4］，皂莢為其中一種［5］。豬牙皂為豆科植物皂莢已衰老或受傷后所結之果實，彎曲成月牙形，又稱小皂莢［6］;性味辛咸、溫、有毒;入肺、胃、大腸經，《湯液本草》云:“入厥陰經”;功用:通竅、滌痰、搜風、殺蟲［7］。本實驗采用豬牙皂正丁醇提取物的含藥血清，體外實驗抑制人肝癌細胞SMMC-7721，利用噻唑藍還原法(MTT法)檢測其抑制率，以觀察豬牙皂的抗肝癌效果。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物 人肝癌SMMC-772l細胞，購于基爾頓生物科技 (上海)有限公司。Wistar雄性大鼠40只，SPF級，體重 (200±20)g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號:SCXK(鄂)2008-005。

1.2 藥物 中藥豬牙皂購于湖北省藥材公司，豬牙皂正丁醇提取物由湖北中醫藥大學藥學院制備。

1.3 主要實驗儀器 微量移液器 (芬蘭大龍移液器)、超凈工作臺 (蘇州集團安泰空氣技術有限公司，型號SW-CJ-1FD)、CO2恒溫培養箱 (SANYO公司，型號 MCO-15AC)、倒置顯微鏡 (OLYMPUS公司，型號IX51)、低溫離心機 (OLYMPUS公司，型號IX51)、低速離心機 (Eppendorf公司，型號 5702R)、酶標儀 (Thermo公司，型號 MULTISKAN MK3)。

1.4 主要實驗試劑及耗材 0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM培養基為美國Gibco公司產品，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒為南京凱基生物科技公司產品，細胞培養皿及細胞培養瓶購自美國Corning公司。

1.5 實驗步驟

1.5.1 豬牙皂正丁醇提取物含藥血清的制備 40只Wistar雄性大鼠隨機分為4組，即:對照組，正丁醇提取物含藥血清按低、中、高劑量組，每組10只大鼠。根據人臨床用量(豬牙皂生藥量1.5g·70kg-1·d-1)、人與大鼠的等效劑量倍數，倍增至7倍為實驗低劑量，按1∶2∶4，設置正丁醇提取物低劑量 (0.15g·kg-1·d-1)組、中劑量 (0.3g·kg-1·d-1)組和高劑量 (0.6g·kg-1·d-1)組，用生理鹽水稀釋至等體積灌胃給藥，對照組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，2次/d，連續2天。第3天上午再給全日劑量灌胃1次 (灌胃前禁食不禁水12小時)，于給藥后0.5～1小時，心臟采血，離心分離血清，合并同組血清，56℃水浴滅活30分鐘，用0.22 μm一次性無菌濾器過濾除菌、分裝，置-20℃冰箱保存備用。

1.5.2 細胞培養 人肝癌SMMC-7721細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃、5%CO2培養箱中常規培養。細胞長滿單層鋪滿培養瓶后，加入適量0.25%的胰蛋白酶液消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.5.3 MTT法測定細胞抑制率 取對數生長期細胞，分別收集計數并調整細胞密度為4×104個/ml，96孔板每孔接入100μl細胞懸液，同時設空白對照組，即孔內加入100μl DMEM培養基，不含細胞，再加入200μl無菌PBS;每組設置5個復孔，37℃，5%CO2繼續培養24小時;吸出孔內細胞培養液，加入預先配置好的含藥血清 DMEM培養基200μl(DMEM:含藥血清 =180μl∶20μl)，37℃，5%CO2繼續培養24小時;小心吸出孔內液體，加入預先配置好混勻的含MTT的 DMEM 培養基 100μl(DMEM:MTT=90μl:10μl)，37℃，5%CO2繼續培養4小時;小心吸出孔內液體，加入二甲基亞砜 (Gibco公司)150μl/孔，室溫低速振蕩10～15分鐘，使紫色結晶充分溶解;用酶標儀測定各孔在波長為492 nm時光密度值(optical density，OD)，細胞抑制率計算公式:生長抑制率 (%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

2 結果

表1 豬牙皂正丁醇提取物含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721存活的影響(，n=5)

表1 豬牙皂正丁醇提取物含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721存活的影響(，n=5)

*與對照組相比，差異有統計學意義;△與高劑量組相比，差異有統計學意義。

圖1 豬牙皂提取物正丁醇部位含藥血清對人SMMC-7721肝癌細胞的存活影響(檢驗水準為α=0.008)

如表1和圖1結果所示:低劑量組與對照組比較差異有統計學意義;中劑量組與對照組比較差異有統計學意義，與高劑量比較差異有統計學意義，與低劑量組比較差異無統計學意義;高劑量與對照組比較差異無統計學意義。

3 討論

原發性肝癌是我國傳統醫藥治療中最常見到效果的腫瘤之一，中醫以整體觀念根據患者的全身特點辨證論治，可以適用于各型各期肝癌［8］。藥物體外抑制肝癌細胞的實驗較多，大多結論提示:對肝癌細胞的抑制效果隨著藥物劑量的增加而增強。本實驗結果卻提示:豬牙皂正丁醇提取物中、低劑量組能夠抑制人肝癌細胞SMMC-7721，高劑量組卻沒有抑制作用。

藥物在機體產生的藥理作用和效應，受藥物和機體多種因素的影響。藥物因素主要有藥物劑型、劑量和給藥途徑、合并用藥與藥物相互作用等;機體因素主要有年齡、性別、種族、遺傳變異、心理、生理和病理因素［9］。合理用藥，需要結合藥物代謝動力學和臨床、實驗具體方案，來調控藥物作用的性質、強度和時間，以增強療效，防止和減輕其毒副作用［10］。本實驗藥物劑量與效應關系，與藥物動力學最大效應的概念一致，即:最大效應隨著劑量或濃度的增加，效應也增加，當效應增加到一定程度后，若繼續增加藥物濃度或劑量而其效應不再繼續增強，這一藥理效應的極限稱為最大效應。這種現象與臨床中藥物的“天花板效應”相似，如:像弱阿片類中的部分激動劑，因為和受體結合后只產生部分效應，而隨著與受體結合的增多，反而會產生拮抗作用。這提示我們實驗與臨床用藥時應尋找最佳藥效的藥物劑量，但這一現象的確切原因和機制尚待進一步深入研究和探討。

［1］胡品津，劉新光.消化內科學 ［M］.北京:人民衛生出版社，2008:188.

［2］汪紅衛，張赤志，蔡岳，等.從痰瘀論治原發性肝癌 ［J］.國際中醫中藥雜志，2013，35(2)，145-146.

［3］楊宗輝，尹建元，魏征人，等.天南星提取物誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及其機制的實驗研究 ［J］.中國老年學雜志，2007，27(2):142-144.

［4］王慶才.生南星、生半夏在腫瘤臨床中的應用［J］.遼寧中醫雜志，1993，20(3):37-38.

［5］杜進軍，張赤志，許漢林，等.皂莢提取物對肝癌細胞小鼠Smad4及Smad7基因調控的影響 ［J］.中西醫結合肝病雜志，2010，20(3):164-165，177.

［6］高學敏.中藥學［M］.北京:中國中醫出版社，2007:351.

［7］江蘇新醫學院.中藥大辭典［M］.上海:上海科學技術出版社，1986:2198.

［8］中國抗癌協會肝癌專業委員會，中國抗癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會，中華醫學會肝病學分會肝癌學組.原發性肝癌規范化診治的專家共識［J］.臨床肝膽病雜志，2009，25(2):91.

［9］楊寶峰.藥理學［M］.北京:人民衛生出版社，2008:27-36.

［10］徐淑云.臨床藥理學［M］.北京:人民衛生出版社，1999:33.