建立結核分枝桿菌抗原K6 IFN-γ ELISPOT用于結核病輔助診斷①

蔣麗氣 黃香玉 陳紅兵 李 靜 何 珂 邵進士 張春青 何秀云

(西南大學生命科學學院，重慶400715)

雖然近幾年結核病得到一定控制，但全球結核病疫情仍然十分嚴重。據WHO統計，全世界約有880萬新增結核病患者［1］。WHO提出全球結核病控制目標為2050年發病率低于百萬分之一，為了實現該目標，結核病疫苗、結核病診斷和治療均需獲得重大突破［2］。目前結核病診斷主要依據臨床表現、影像學檢查、實驗室檢測(血清結核抗體檢測、分子生物學檢測(PCR、核酸雜交)、細菌學檢查(涂片抗酸染色、結核分枝桿菌培養、噬菌體、化學發光)等［3］，這些方法有的敏感度低、有的檢測周期長、有的需技術含量高［3，4］。我國規定結核分枝桿菌培養陽性為診斷金標準［3］。結核分枝桿菌培養需時太長、不能滿足臨床。血清抗體檢測、結核菌素皮膚試驗(TST)、涂片抗酸染色等均可做到快速檢測，但WHO于2011年7月提出結核病血清抗體作為結核病診斷可能存在誤診(www.who.org)、TST特異度低、涂片抗酸染色敏感度低。

結核分枝桿菌致敏的T淋巴細胞，再次受到相關抗原刺激后能迅速活化增殖并釋放γ-干擾素(IFN-γ)。IFN-γ 釋放試驗(Interferon gamma release assay，IGRA)是目前特異度高、快速、且可取代TST試驗最有效方法，IGRA包括酶聯免疫斑點法(ELISPOT)或酶聯免疫吸附劑測定法(ELISA)。澳大利亞生產的QFT試劑盒(ELISA)和英國生產的TSPOT.TB試劑盒(ELISPOT)已批準用于臨床檢測結核分枝桿菌感染。QFT試劑盒刺激抗原有3個，即6 kD早期分泌抗原靶(ESAT-6)、培養濾過蛋白10(CFP-10)和RD11區TB7.7，3個抗原加入同一管共同刺激［4］。T-SPOT.TB試劑盒刺激抗原為抗原A(ESAT-6多肽)和抗原B(CFP-10多肽)，抗原A 和抗原 B 單獨刺激［2，4，5］。國外生產試劑盒在中國銷售價格昂貴，為了降低檢測費用，國內多家科研單位或(和)生物公司進行結核IGRA試劑盒研發。從去年開始，我國研制的結核IGRA檢測試劑盒陸續獲得國家食品藥品監督管理局批準的注冊證書。因此，IGRA用于結核病細胞免疫學診斷逐漸得到重視和認可。但是，國內外獲批準的結核IGRA試劑盒所用刺激抗原均包含ESAT-6和 CFP-10抗原或其多肽、且不能區分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染。因此篩選新刺激抗原，研制具有自主知識產權的結核IGRA試劑盒用于活動性結核病診斷具有重要意義。

基因工程技術獲得了一種結核分枝桿菌融合蛋白(K6)，前期研究發現K6與佐劑聯合免疫小鼠可產生較高水平IFN-γ，本文建立K6作為刺激原的IFN-γ ELISPOT檢測方法，并初步評價該方法用于結核病輔助診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 BSC-1360 A2二級生物安全柜(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，CO2培養箱(日本三洋)，臺式低速離心機(L-530，湖南湘儀離心機有限公司)，熒光顯微鏡(Olympus cx31，日本)，酶聯免疫斑點讀板儀［Cellular Technology Limited(CTL)，美國］。

1.1.2 試劑 結核感染T細胞斑點檢測試劑盒［TSPOT.TB(Oxford Immunotec，UK)］購自上海復星長征醫學科學有限公司，RPMI1640培養液(Thermo)購自北京索萊寶科技有限公司，結核分枝桿菌重組融合抗原K6(本室研制)，人全血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，AIM培養基購自上海復星長征醫學科學有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對象 解放軍第三O九醫院結核病研究所2012年3～6月新入院且臨床最終確診的結核病患者85例，其中單一肺結核病患者29例、肺結核病合并其它部位結核病患者43例、肺外結核病患13例。男59例、女26例，平均年齡36.6歲(11～79歲)。56例非結核性肺部相關疾病(肺炎和肺癌)患者來自解放軍第三O九醫院呼吸科和腫瘤科，男35例、女21例，平均年齡58.3歲(20～89歲)。肺結核病診斷標準:(1)典型肺結核臨床癥狀和胸部X射線表現;(2)痰或支氣管灌洗液涂片抗酸染色陽性;(3)痰或支氣管灌洗液結核分枝桿菌培養陽性;(4)痰結核分枝桿菌PCR陽性;(5)PPD(5 TU)強陽性，血清抗結核抗體陽性;(6)臨床可排除其它非結核性肺部疾患;(7)抗結核治療有效。符合(1)和(7)及(2)～(6)中至少2項者診斷為肺結核。肺外結核和肺炎為臨床綜合診斷，肺癌經病理確診。

1.2.2 外周血單個核細胞分離 新入院結核病患者(抗結核藥物治療前)和非結核性肺部相關疾病患者靜脈抽取4 ml外周血于肝素鋰抗凝管中，外周血與等體積無菌生理鹽水上下顛倒混勻，無菌吸管吸取上述稀釋外周血緩慢加入到與外周血等體積的人單個核細胞分離液上面，1 700 r/min常溫離心20分鐘;用無菌吸管吸起環狀乳白色PBMC層，10 ml RPMI1640培養基洗滌兩次，2 000 r/min離心10分鐘;0.5 ml AIM懸浮細胞沉淀，取10 μl細胞稀釋50倍，臺盼藍染色，計數，細胞活率均在90%以上，調整細胞濃度2.5×106個/ml。

1.2.3 ELISPOT檢測分泌IFN-γ的斑點形成細胞數(Spot forming cells，SFC) 按T-SPOT.TB試劑盒說明書稍加改進。具體為:依次加入50 μl AIM(陰性對照)、陽性質控、抗原A、B和1～4個不同濃度抗原K6(根據細胞數)于對應的檢測孔，每孔加入100 μl細胞懸液，于 5%CO2、37℃ 孵育過夜(20 ～24小時)。取出微孔板棄去細胞懸液，每孔加200 μl PBS(0.22 μm過濾)洗板至少6次，每孔依次加入50 μl堿性磷酸酶標記抗體，4℃孵育60分鐘;棄去酶溶液，同上洗板至少6次，每孔加入50 μl BCIP/NBT底物溶液，室溫放置7分鐘，蒸餾水洗滌各孔，將微孔板置通風處避光干燥。酶聯免疫斑點讀板儀自動檢測SFC數。當陽性質控孔中SFC遍布整個反應孔為有效，陰性對照孔SFC數為0～5個時且(抗原A、B或K6孔的SFC數)-(陰性對照孔SFC數)≥6或陰性對照孔SFC數≥6時且(抗原A、B或K6孔的SFC數)≥2×(陰性對照孔SFC數)為相應抗原刺激反應陽性;反之判為陰性。若陽性質控孔SFC數量小于20，則判定試驗無效。

1.3 結果分析 SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，敏感度和特異度采用卡方(χ2)檢驗，SFC數量平均值比較采用一元方差分析，抗原K6、抗原A和抗原B診斷一致性采用非參數Kappa檢驗，抗原K6、抗原A和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量相關分析采用Bivariate Correlations;P＜0.05為差異有統計學意義。GraphPad Prim 5軟件繪制散點圖。

2 結果

2.1 抗原K6 IFN-γ ELISPOT用于結核病輔助診斷

2.1.1 統計病例 新入院高度懷疑結核病的患者納入，出院時臨床明確診斷不是結核病病例剔除。肺癌為病理確診、肺炎為臨床診斷，兩類患者均未進行結核分枝桿菌感染篩查。因為采用進口結核病臨床診斷試劑盒、一份標本同時進行自研制抗原K6與試劑盒抗原A和抗原B比較;另一方面，針對新入結核病患者是排除不同化療或免疫治療對IFN-γ ELISPOT檢測的影響。結核分枝桿菌培養陽性較低，獲得具有統計意義的培陽肺結核需要基數大，試劑盒價格昂貴。基于以上考慮，結核病患者未按金標準選擇病例、而是綜合診斷。統計時只分為結核病組(包括肺結核患者29例、肺結核合并其它肺外結核43例和肺外結核13例)和非結核性肺部相關疾病組(肺癌17例、肺炎39例)。

2.1.2 抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ 預試驗比較了2.5、5、10和20 μg/ml K6對 SFC數量和敏感度影響，2.5 μg/ml抗原獲得SFC數量與其它3個濃度抗原刺激SFC比較，差異無統計學意義(P＞0.05，圖1);但敏感度顯著低于5 μg/ml(71.9%vs 87.7%，χ2=3.7，P ＜0.05)。5 μg/ml與 10 μg/ml和20 μg/ml比較，SFC數量和敏感度均無統計學差異(P＞0.05)，因此確定抗原 K6刺激濃度為5 μg/ml。

2.1.3 抗原K6診斷敏感度和特異度 抗原K6診斷敏感度為80.0%(68/85)。T-SPOT.TB試劑盒敏感度是抗原A或抗原B診斷陽性(抗原A/B敏感度)，抗原A/B診斷敏感度為85.9%(73/85，表1);抗原K6與抗原A/B敏感度比較差異無統計學意義(χ2=1.04，P=0.31)。抗原A和抗原B敏感度分別為78.8%(67/85)和72.9%(62/85)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.88，P=0.35)。抗原K6特異度為83.9%(47/56)，抗原 A/B特異度為73.2%(41/56，表2)。抗原K6與抗原A/B特異度比較差異無統計學意義(χ2=1.93，P=0.17)。抗原A和抗原B特異度分別為82.1%(46/56)和73.2%(41/56)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=1.29，P=0.26)。

抗原K6、抗原A/B作為刺激原的IFN-γ ELISPOT診斷結核病的陽性預示值分別為88.3%(68/77)和82.9%(73/88)，陰性預示值分別為73.4%(47/64)和77.3%(41/53)。

2.1.4 抗原K6與T-SPOT.TB診斷相關性分析結核病組，抗原K6與抗原 A診斷一致性較高(94.2%，Kappa=0.82)，與抗原A/B診斷一致性較高(91.7%，Kappa=0.711)，但與抗原B診斷一致性較低(81.4%，Kappa=0.481)。非結核性肺部相關疾病組，抗原 K6與抗原 A診斷一致性較高(96.4%，Kappa=0.867)，與抗原A/B診斷一致性較高(89.3%，Kappa=0.682)，而與抗原B診斷一致性稍低(85.7%，Kappa=0.593)。

2.2 抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量

結核病組，20個患者PBMC經抗原B刺激分泌IFN-γ的SFC數量超過100個，而只有7個患者PBMC經抗原A或抗原K6刺激分泌IFN-γ的SFC數量超過100個(圖2)。同一抗原刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量，結核病組普遍高于非結核性肺部相關疾病組(圖2)。

結核病組，抗原 B刺激 PBMC分泌 IFN-γ的SFC數量(平均為77個)分別高于抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量(平均為46個和43個)，差異有統計學意義(P=0.011和P=0.004);抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌 IFN-γ的SFC數量比較，差異無統計學意義(P=0.732)。非結核性肺部相關疾病組，抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量(平均為9個)分別與抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量(平均數為14個和13個)比較，差異無統計學意義(P=0.592和P=0.609);抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量比較，差異無統計學意義

(P=0.983)。

圖1 ELISPOT檢測特異抗原刺激PBMC分泌IFN-γ的SFCFig.1 Spot forming cells secreting IFN-γ of peripheral blood mononuclear cell stimulated by specific antigen

表1 結核病患者IFN-γ ELISPOT檢測結果Tab.1 The results of IFN-γ ELISPOT for tuberculosis patients

表2 非結核肺部相關疾病患者ELISPOT檢測結果Tab.2 The results of IFN-γ ELISPOT for nontuberculous pulmonary disease

圖2 不同抗原刺激分泌IFN-γ的SFC數量散點圖Fig.2 Scatter plots of spot forming cells secreting IFN-γ stimulated by specific antigen of Mycobacterium tuberculosis

結核組，抗原K6和抗原A刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量呈正相關(r=0.856，P=0.000)，抗原K6和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量呈正相關(r=0.234，P=0.024)，抗原A和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量呈正相關(r=0.304，P=0.003)。非結核性肺部相關疾病組，抗原K6和抗原A刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量呈正相關(r=0.982，P=0.000)，抗原K6和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量呈正相關(r=0.611，P=0.000)，抗原A和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數量呈正相關(r=0.586，P=0.000)。

3 討論

IGA是目前公認用于結核分枝桿菌感染篩查優于TST的一種細胞學診斷方法。本文采用T-SPOT.TB試劑盒中預包被板和顯色試劑及自研制的抗原K6作為刺激原建立IFN-γ ELISPOT，該方法用于新入院結核病患者診斷敏感度和特異度分別為80.0%和 83.9%，與 T-SPOT.TB診斷敏感度(85.9%)和特異度(73.2%)相當;也與文獻報道TSPOT.TB與自研制RD1區抗原ELISPOT診斷初治肺結核敏感度(分別為89.7%和79.3%)相當，肺結核化療未影響T-SPOT.TB診斷敏感度(87.5%)，但顯著降低自研制RD1區抗原ELISPOT診斷敏感度(25%)［6］。K6 刺激PBMC分泌IFN-γ是否受化療影響需進一步驗證。結核IGA還可用于肺外結核輔助診斷，如結核性胸膜炎、骨結核等［7，8］;同時還可用于結核病疫苗評價［9，10］。K6 抗原 IFN-γ ELISPOT也可用于肺外結核診斷，但本研究納入的肺外結核病例較少，因此與肺結核合并進行統計學分析。

T-SPOT.TB與QFT-IT檢測一般采用外周血，但也可采用感染部位細胞。結核性胸膜炎患者，外周血和胸水QFT-IT診斷敏感度和特異度均相當［7］。另報道結核性胸膜炎患者胸水單核細胞ELISPOT檢測獲得滿意結果，敏感度達到92.5%、特異度為80.0%［11］。但是除了胸水、腦積液等，其他感染部位單核細胞很難獲得，因此，外周血是結核IGA檢測最主要的標本來源。

結核IGA和TST均反映機體細胞免疫狀態，研究發現HIV、系統紅斑狼瘡(SLE)等原因引起機體免疫功能降低到一定限度才影響結核IGA檢測。結核病合并HIV感染不影響結核IGA檢測，因為TSPOT.TB分別用于HIV感染者和HIV非感染者檢測結核分枝桿菌感染診斷，其一致性很高［12］。但HIV感染者CD4數量小于200時，T-SPOT.TB和QFT-IT檢測結核分枝桿菌感染敏感度低于5%;但當HIV感染者CD4數量大于200時，T-SPOT.TB和QFT-IT檢測敏感度恢復正常，分別為10.9%和9.1%;此時TST檢測敏感度為16.4%［13］。TST反映大于10 mm的SLE患者，TST與QFT-IT診斷一致性很高［14］。

T-SPOT.TB和QFT-IT均不能區分活動性結核病與結核分枝桿菌感染，研制診斷活動性結核病的試劑盒顯得十分必要。一方面篩選新刺激抗原、一方面尋找新細胞因子標識［15］。研究發現Rv1985c可區分結核病患者、結核分枝桿菌潛伏感染者同BCG接種者，Rv1985c與ESAT-6、CFP-10聯合可提高診斷敏感度、不降低特異度［16，17］。Rv2629、Rv1009和 Rv2389c是IFN-γ分泌的強免疫刺激原，而Rv0574c、Rv2630、Rv1998 和 Rv054c是 IL-8、IL-6和IL-17分泌的強免疫刺激原［18］。比較ESAT-6、CFP10、Rv2031c、Rv2654c和 Rv1038c的重疊肽體外刺激效果發現CFP10最好，其次是ESAT-6、Rv2031c和 Rv1038c 居中，Rv2654c 無刺激活性［19］。IFN-γ ELISA 表明 Rv0867c、Rv2389c、Rv2450c、Rv1009 和Rv1884c 可診斷活動性結核病［20］。IFN-γ ELISPOT表明Rv3873、Rv3878和Rv3879c可用于潛伏感染向活動性結核進展的檢測［21］。肺結核患者支氣管灌洗液分泌Rv2628特異的IFN-γ CD4+T細胞顯著高于PBMC，但其反應強度低于RD1抗原［22］。ESAT-6的三個肽刺激效果好于CFP-10的C14多肽(52～65氨基酸)［23］。我們結果表明 K6刺激 PBMC分泌IFN-γ的強度低于抗原B(CFP-10多肽)、與抗原A相當，但三種抗原診斷敏感度比較差異無統計學意義。

抗原K6可作為IFN-γ ELISPOT候選抗原之一，將進一步評價抗原K6區分活動性結核與結核分枝桿菌潛伏感染、結核分枝桿菌感染與BCG接種的應用價值。

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