胰腺癌細(xì)胞中GDNF對(duì)MMP-9表達(dá)的影響*

郭仁德王偉忠 顧建華王 毅 谷 川

胰腺癌發(fā)生胰周神經(jīng)浸潤的比例高達(dá)53.5%～100%[1]，神經(jīng)浸潤被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的極為重要的因素，但其確切分子機(jī)制至今尚不明確。近年來的一些研究表明，由胰腺內(nèi)外的神經(jīng)組織產(chǎn)生的許多神經(jīng)營養(yǎng)因子、黏附分子參與了胰腺癌的神經(jīng)侵襲過程，其中膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）在此過程中的作用日益受到重視[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是一個(gè)蛋白水解酶家族，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中蛋白成分的降解，在腫瘤細(xì)胞侵犯中起非常重要的作用[3]。近年來有研究顯示MMP-9在胰腺癌中過度表達(dá)，并且與蛋白水解反應(yīng)、淋巴侵犯及GDNF的表達(dá)相關(guān)[4]。本研究采用不同檢測(cè)方法，旨在探討胰腺癌細(xì)胞中GDNF對(duì)MMP-9表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2（M.D.Andson癌癥中心饋贈(zèng)），Capan-2（中南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院饋贈(zèng)），GDNF蛋白（天津市津脈基因測(cè)繪技術(shù)有限公司），鼠抗人RET單克隆抗體 （北京中杉生物技術(shù)有限公司），MMP-9多克隆抗體、TaqDNA聚合酶（美國Santa Cruz公司），MMP-9 ELISA試劑盒 （北京中杉生物技術(shù)有限公司），試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 （天津?yàn)螅Ｆ胀≒CR儀:GeneAmp PCR Systerm 9700， 梯度 PCR 儀：Mastercycler gradient，KODAK 凝膠成像系統(tǒng):Kodak digital science image station 440，酶標(biāo)儀（TECAN A-5082）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞中GDNF對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 胰腺癌MIA PaCa-2和Capan-2細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)照組用DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入100μg/L GDNF培養(yǎng)24 h。胰腺癌RNA提取，進(jìn)行濃度測(cè)定和質(zhì)量判定，RT-PCR法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)。MMP-9引物應(yīng)用Oligo 6.0軟件自行設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。序列上游：5′-TCTGGAGGTTCGACGTGAAG-3′；下游：5′-GGGCACTGCAGGATGTCATA-3′， 引物長度 220 bp。PCR反應(yīng)體積為25μL，含 cDNA模板 2μL以及 1.5μmol/L MgCl2、50μmol/L dNTPs、上下游引物各0.1 μmol/L 和TaqDNA聚合酶1 U。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s、53℃退火45 s、72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物常規(guī)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。每次擴(kuò)增均設(shè)DMEM陰性對(duì)照組，每組5孔，各重復(fù)5次。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響 胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)照組用DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入100μg/L GDNF培養(yǎng)24 h,每組5孔。消化離心收集細(xì)胞后，PBS清洗3遍，將細(xì)胞置于1.5 mL EP管中，加入1 mL（含1%PMSF）的RIPA裂解液，搖勻置于冰上裂解30 min，裂解后于4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液并測(cè)定蛋白濃度，取40μg蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，置于十二烷基硫酸鈉（SDS）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用 1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，用稀釋度1∶1 000的兔抗人MMP-9多克隆抗體4℃過夜，加入相應(yīng)的二抗室溫下孵育60 min，按試劑盒說明書進(jìn)行抗體檢測(cè)。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品光密度（OD）450值畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，MIA PaCa-2和Capan-2胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)，待培養(yǎng)液中細(xì)胞貼壁生長且基本鋪滿瓶底，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，胰酶消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞制成2×104/mL懸液。將細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔加入200 μL培養(yǎng)液。每種細(xì)胞分別設(shè)置7組：GDNF最終質(zhì)量濃度分別為0、10、20 、50、80、100 和 120 μg/L，每組 5 孔。37 ℃，5%CO2分別培養(yǎng)24、48和72 h。移液器分別取100μL培養(yǎng)基酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包，兩均數(shù)間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GDNF對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 MIA PaCa-2和Capan-2兩種胰腺癌細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組MMP-9表達(dá)條帶較對(duì)照組明顯增粗、變亮，見圖1、2。

2.2 Western blot法檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響 MIA PaCa-2和Capan-2兩種胰腺癌細(xì)胞系中，對(duì)照組有很弱的MMP-9蛋白的表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組MMP-9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，見圖3。MIA PaCa-2和Capan-2細(xì)胞系中對(duì)照組MMP-9蛋白表達(dá)分別為1.3±0.2和1.1±0.4，實(shí)驗(yàn)組分別為1.9±0.3和1.8±0.7，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t分別為3.171 和 3.219，均 P<0.01）。

Figure 1 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 mRNA in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line圖1 MIA PaCa-2胰腺癌細(xì)胞系中GDNF對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

Figure 2 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 mRNA in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line圖2 Capan-2胰腺癌細(xì)胞系中，GDNF對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

Figure 3 The expression of MMP-9 protein圖3 MMP－9蛋白的表達(dá)

2.3 ELISA法檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響 MIA PaCa-2和Capan-2胰腺癌細(xì)胞系中，均可見代表MMP-9蛋白表達(dá)水平的OD450值隨加入GDNF值的增高而增高，于GDNF濃度為100μg/L，48 h 時(shí)達(dá)最大值，見圖4、5，表1、2。

3 討論

胰腺癌在生物學(xué)行為上具有高度侵襲性，腫瘤很小時(shí)即可有神經(jīng)、血管或周圍淋巴的侵犯，甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已屬于晚期胰腺癌，即使獲得手術(shù)切除，術(shù)后也很快復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后仍然很差。近年來，隨著影像醫(yī)學(xué)的發(fā)展，一些早期胰腺癌可被發(fā)現(xiàn)，但侵襲與轉(zhuǎn)移仍是治療失敗和因瘤死亡的主要原因。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程主要依賴于侵襲性腫瘤細(xì)胞蛋白溶解活性的增強(qiáng) 。MMPs、組織蛋白酶B和D以及纖溶酶原激活物是參與轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過程（metastaticcascade）的化學(xué)物質(zhì)[5]。

Figure 4 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line圖4 MIA PaCa-2胰腺癌細(xì)胞系中GDNF對(duì)MMP－9蛋白表達(dá)的影響

Figure 5 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line圖5 Capan－2胰腺癌細(xì)胞系中GDNF對(duì)MMP－9蛋白表達(dá)的影響

Table 1 Statistics of influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line表1 MIA PaCa-2胰腺癌細(xì)胞系中GDNF對(duì)MMP－9蛋白表達(dá)影響的統(tǒng)計(jì)量

Table 2 Statistics of influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line表2 Capan-2胰腺癌細(xì)胞系中GDNF對(duì)MMP－9蛋白表達(dá)影響的統(tǒng)計(jì)量

MMPs是一組鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶，屬于蛋白水解酶的一種，它的作用底物較多，有纖維膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白、明膠及蛋白多糖等，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。近年來的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)MMP在惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。目前，MMPs家族由11個(gè)成員組成。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性將其劃分成4組：膠原酶、白明膠酶、基質(zhì)降解酶及其他。MMP-9又稱為明膠酶B，是MMPs中分子量最大的酶。以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，降解、破壞靠近腫瘤表面的Ⅳ型、V型膠原和明膠，然后腫瘤細(xì)胞沿著缺失的基底膜向周圍浸潤，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。另一方面則通過毛細(xì)血管內(nèi)生、新生血管生成等促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。因此，MMP-9在癌細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移中起重要作用。

Okada等[7-8]對(duì)GDNF是否能調(diào)節(jié)人胰腺癌細(xì)胞MMP-9的表達(dá)和活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示GDNF提高M(jìn)IA PaCa－2細(xì)胞株中MMP-9 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)是有劑量依賴性的。GDNF增強(qiáng)了前體和活性形式MMP-9溶解明膠的能力。抑制物試驗(yàn)顯示前體MMP-9的表達(dá)和活性能被genistein完全抑制，被Wortmannin部分抑制，而PD98059沒有影響。三者都能抑制MMP-9的活性，說明在MIA PaCa-2中，GDNF通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路上調(diào)MMP-9的表達(dá)和酶活性，GDNF可能通過調(diào)控MMP-9的表達(dá)和活性促進(jìn)了胰腺癌的侵犯。本研究利用RT-PCR法檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示加入100μg/L GDNF后，MMP-9 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示胰腺癌細(xì)胞中GDNF能上調(diào)MMP-9 mRNA的表達(dá)。

本研究應(yīng)用Western blot法檢測(cè)檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響，對(duì)照組有很弱的MMP-9蛋白的表達(dá)，而加入100μg/L GDNF組MMP-9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，采用雙夾心ELISA法檢測(cè)GDNF對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響，顯示代表MMP-9蛋白表達(dá)水平的OD450值隨加入GDNF值的增高而增高，于GDNF濃度為100μg/L，作用48 h達(dá)最大值，提示GDNF可上調(diào)MMP-9蛋白的表達(dá)。但是由于MMP-9蛋白表達(dá)量較低，未能從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取具體數(shù)值，還需一種更為精細(xì)的方法來測(cè)量。

綜上所述，GDNF具有上調(diào)胰腺癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)的作用,可促進(jìn)MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

[1]Nagakawa T,Kayahara M,Uena K,etal.A clinicopathologic study on neural invasion in cancer of the pancreatic head[J].Cancer,1992,69(4):930.

[2]Lu DY,Leung YM,Cheung CW,etal.Glial cell line-derived?neurotrophic factor induces cell migration and matrix metalloproteinase-13expression in glioma cells [J].Biochem Pharmacol,2010,80(8):1201-1209.

[3]Yeh WL,Lu DY,Lee MJ,etal.Leptin induces migration and invasion of glioma cells through MMP-13 production[J].Glia,2009,57(4):454–464.

[4]Okada Y,Eibl G,Duffy JP,etal.Glial cell-derived neurotrophic factor upregulates the expression and activation of matrix metalloproteinase-9 in human pancreatic cancer[J].Surgery,2003,134(2):293-299.

[5]Pryczynicz A,Guzińska-Ustymowicz K,Dymicka-Piekarska V,etal.Expression of matrix metalloproteinase 9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumor metastasis formation[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(1):37-40.

[6]Kuhlmann KF,van Till JW,Boermeester MA,etal.Evaluation of Matrix Metalloproteinase 7 in Plasma and Pancreatic Juice as a Biomarker for Pancreatic Cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(5):886-891.

[7]Okada Y,Eibl G,Duffy JP,etal.Glial cell-derived neurotrophic factor upregulates the expression and activation of matrix metalloproteinase-9 in human pancreatic cancer[J].Surgery,2003,134(2):293-299.

[8]Chen YJ,Wei YY,Chen HT,etal.Osteopontin increases migration and MMP-9 up-regulation via alphavbeta3 integrin,FAK,ERK,and NF-kappaB-dependent pathway in human chondrosarcoma cells[J].JCell Physiol,2009,221(1):98-108.