自動凈化及新型酶聯免疫法測定廢氣中的二噁英

周志廣，許鵬軍，任 玥，李 楠，齊 麗，鄭 森，趙 虎，范 爽，張 烴，劉愛民，黃業茹，高木陽子

(1.國家環境分析測試中心 國家環境保護二英污染控制重點實驗室，北京 100029;2.京都電子工業株式會社，日本 京都 601－8317)

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正己烷(美國J.T-Baker)，DMSO(日本Wako Pure Chemical)，13C取代的凈化內標和13C取代的進樣內標(加拿大Wellington Laboratory)，多層硅膠柱和氧化鋁柱(日本三浦環境科學研究所)，Milli-Q plus純水器(美國Millipore公司);分析儀器采用Waters公司生產的AutoSpec ULtima NT型高分辨氣相色譜－高分辨質譜聯用儀(HRGC－HRMS)以及與京都電子公司共同開發研制的SPD－600、DXS－600。

實驗所用的樣品為廢棄物焚燒后產生的廢氣樣品。

1.2 自動前處理儀器實驗條件的優化

SPD－600儀器基本結構如圖1，其中2和3是簡化的多層硅膠柱和氧化鋁柱。簡化多層硅膠柱的基本構成為:硫酸鈉(2 g)+2%氫氧化鉀硅膠(0.8 g)+硅膠(0.05 g)+44% 硫酸硅膠(7.3 g)+硅膠(0.05 g)+10% 硝酸銀硅膠(3.5 g)+硫酸鈉(2 g)。

采用廢氣樣品，首先研究了加熱對多層硅膠柱凈化效率的影響，將采集到的廢氣樣品均分為兩份，分別加到多層硅膠柱上，按照下述條件進行凈化處理:①130 mL正己烷、室溫下淋洗;②90 mL正己烷、60℃下淋洗。

其次進行了溶劑置換效率的研究:凈化完畢的樣品經氧化鋁柱分離后，置換成DMSO，溶劑置換效率將直接影響后續測定結果，為此通過對比凈化內標回收率來驗證溶劑的置換效率。將兩份分別添加了凈化內標的廢氣樣品，1份按照HJ77.2－2008方法凈化，另1份按照SPD－600設定的條件凈化，將此凈化完畢溶解在DMSO中的樣品，采用液－液萃取置換成正己烷，然后進行高分辨氣相色譜－高分辨質譜(HRGC－HRMS)分析，每個樣品分別做3次平行實驗。

1.3 自動測定儀器的原理及其與普通酶聯免疫方法的比較

DXS－600是一種自動測定儀器，其原理為基于酶聯免疫的結合平衡除外法?？贵w的制備過程如下:將牛血清蛋白(BSA)與二英類物質結合得到的復合物(DXN－BSA)作為抗原，注射到小鼠的體內，使其在體內產生二英抗體，取出脾臟細胞與骨髓瘤細胞，然后結合制備雜交瘤細胞。以該雜交瘤細胞與廢氣中TEQ高相關性的異構體的結合性為指標進行篩選，再通過克隆培養，取得能與二英類產生特異性結合的抗二英類單克隆抗體細胞;測定單元中的固相抗原為2，4，5-TCP－BSA。采用標準溶液濃度系列分別進行普通酶聯免疫方法和DXS－600測試，每種方法進行3次平行測試，將測得的結果進行四參數回歸得出標準曲線，并對標準曲線進行比較。

圖1 樣品凈化和溶劑置換裝置示意圖Fig.1 Diagram of experimental purification and solvent substitution system

2 結果與討論

2.1 自動前處理儀器實驗條件的優化

2.1.1 加熱對多層硅膠柱凈化效率的影響 將在不同條件下凈化完畢的樣品分別進行紫外光譜分析(圖2)，從圖2可以看出，室溫下、130 mL正己烷淋洗，凈化后的樣品在260 nm下具有很強的吸收。這表明凈化的樣品中存在不飽和芳香族化合物，此類化合物中，其中一些物質具有與二英類物質相似的結構并呈現出相似的毒性，因此極易與抗體結合，影響檢測結果，必須去除［17］。而60℃加熱、90 mL正己烷淋洗，凈化完畢的樣品，在260 nm下的吸收較弱。為了得到詳細的信息，將此兩份樣品進行氣相色譜－質譜(GC－LRMS)分析(如圖3)。從色譜圖的對比可以看出，在加熱條件下凈化的樣品，多環芳烴(PAH)、烷基苯(ABz)、烷基聯苯類等化合物峰明顯減少。而且研究表明加熱后二英類化合物的出峰時間會提前，從而縮短凈化時間［17］。從以上對比研究可以看出，60℃加熱條件下進行凈化可以提高凈化效率、縮短凈化時間。

圖2 在室溫和60℃條件下凈化后廢氣樣品的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of flue gas samples purified by multilayer silica gel column at room temperature and 60℃

圖3 在室溫和60℃條件下凈化后的廢氣樣品的GC－LR/MS圖Fig.3 GC－LRMS chromatograms of flue gas samples purified by multi-layer silica at room temperature and 60℃

2.1.2 凈化內標回收率的對比研究 按“1.2”的有關步驟進行了加標回收對比(見表1)。從對比結果可以看出，按照HJ77.2－2008標準分析方法人工填制的凈化柱的回收率為78%～122%，相對標準偏差為1%～19%，而SPD－600的回收率為87%～107%，相對標準偏差為2%～8%。SPD－600凈化分離后的樣品內標回收率高于按照標準分析方法人工填制的凈化柱，相對標準偏差范圍也較小，很大程度上消除了人為因素的影響。同時本方法只采用90 mL正己烷淋洗，而HJ77.2－2008標準分析方法中則需用200 mL正己烷淋洗凈化柱，200 mL二氯甲烷－正己烷(1∶3)以及200 mL甲苯淋洗活性炭柱。因此，SPD－600儀器使用較少的溶劑，就可使回收率滿足分析要求。因此該系統完全可以滿足各種生物檢測方法中樣品前處理的需要。

綜合上述研究，確定最佳的樣品處理流程如下:樣品采用簡化的多層硅膠柱和氧化鋁柱凈化，對此組合柱進行60℃加熱，采用90 mL正己烷以2.5 mL/min的速率進行淋洗。最后采用0.7 mL DMSO將二英類化合物溶出，DMSO的淋洗速率為2.5 mL/min，樣品制備完畢后，避光、0℃以上保存。

表1 人工凈化柱和SPD－600凈化柱回收率之間的比較Table 1 Comparison of recoveries between manually packed column and alumina column used by SPD－600

2.2 自動測定儀器

圖4 測量的基本原理Fig.4 The principle of measurement

在酶聯免疫方法中，標準曲線中只有直線部分是可取的。從圖5兩條標準曲線的對比可以看出，DXS－600曲線的直線范圍比普通的酶聯免疫方法大，檢出下限由1.1 μg/L降低至0.025 μg/L，靈敏度提高了近40倍，同時由于DXS－600是自動測定儀器，消除了實驗過程中不確定因素的影響。對比分析發現，實驗結果的重現性(相對標準偏差)由8.0%～18%變為2.2%～4.8%，另外此儀器一次可測定3個樣品，縮短了分析時間，可用于大批量樣品的測試。

圖5 DXS－600和ELISA標準曲線的比較Fig.5 Comparison of calibration curves between DXS－600 and ELISA

表2 WHO－TEF(2005)與交叉反應值的比較Table 2 Comparison of WHO－TEF(2005)and cross reactivity

2.3 SPD－600凈化+DXS－600測定與HRGC－HRMS測定結果之間的比較

實驗采用SPD－600和DXS－600聯用分析了21個廢棄物焚燒產生的廢氣樣品，并將測定的結果與HRGC－HRMS進行了比較。結果表明，在一定濃度范圍內此儀器組合測定的結果與HRGC－HRMS測定的結果表現出良好的線性關系，兩者的換算方程為y=1.541x－1.906，r2=0.985 8。由于此儀器組合操作簡單、自動化程度較高、凈化時間和測定時間較短，因此在一定的使用范圍內可用于二英的快速篩查。

3 結論

致謝:本研究承蒙日本京都電子株式會社立石典生、竹內義清等人員的幫助，在此表示感謝。

［1］Fernandez－ Salguero P M，Hilbert D M，Rudikoff S，Ward J M，Gonzalez F J.Toxicol.Appl.Pharmacol.，1996，140:173－179.

［2］Mimura J，Yamashita K，Nakamura K，Morita M，Takagi T N，Nakao K，Ema M，Sogawa K，Yasuda M，Katsuki M，Fujii－Kuriyama Y.Genes Cells，1997，2:645－654.

［3］Poland A.Annu.Rev.Pharmacol.，1982，22:517 －542.

［4］Safe S H.Annu.Rev.Pharmacol.，1986，26:371 －399.

［5］Smith L M，Salling D L，Johnson J L.Anal.Chem.，1984，56:1830－1842.

［6］Rappe C.Environ.Sci.Technol.，1984，18:78A －90A.

［7］Liemd A K D.Trends Anal.Chem.，1999，18(6):429－439.

［8］Liemd A K D.Trends Anal.Chem.，1999，18(7):499－507.

［9］Behnisch P A，Hosoe K，Sakai S.J.Environ.Int.，2001，(27):413 －439.

［10］No.92 Bulletin，Ministry of Environmental Government of Japan，2005，http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/manual/edr_sim － method/bio_manual.pdf.

［11］Besselink H，Jonas A，Pijnappels M，Swinkels A，Brouwer B.Organohalogen Compd.，2004，66:677－681.

［12］Matsuki T，Nakama E，Kishino J，Tokuda Y，Takagi Y，Kataoka C，Hamada N，Fujita H，Tateishi N，Sawadaishi K，Hoda K.Organohalogen Compd.，2005，67:39 －41.

［13］Ohmura N，Lackie S J，Saiki H.Anal.Chem.，2001，73(14):3392－3399.

［14］Robert C，BlakeⅡ，Diane A M.Methods in Molecular Biology，2003，248:417－430.

［15］Thomas R G，Hiroshi S，Takashi J，Yukihiro T，Naoya O，Steve J L.Biosens.Bioelectron.，2004，20:397－403.

［16］Harrison R O，Eduljee G H.Science of the Total Environment，1999，239:1－18.

［17］Vanden B M，Birnbaum L，Bosveld A T，Brunstrom B，Cook P，Feeley M，Giesy J P，Hanberg A，Hasegawa R，Kennedy S W，Kubiak T，Larsen J C，Van L F X，Liem A K，Nolt C，Peterson R E，Poellinger L，Safe S，Schrenk D，Tillitt D，Tysklind M，Younes M，Waern F，Zacharewski T.Environ.Health Perspect，1998，106:775－792.

［18］Jun K，Yoshinori T，Yoko T，Chiwa K，Hiroyuki F，Noriaki H，Kazuyuki S，Katsuhisa H.Organohalogen Compd.，2004，66:715－722.