高效液相色譜法測定肉制品中梔子黃色素含量

周偉娥，凌 云，張 元，李紹輝，蔣受軍，姚美伊，李紅娜，鄭 陽，張 峰,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100123；2.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530299）

高效液相色譜法測定肉制品中梔子黃色素含量

周偉娥1,2，凌 云1，張 元1，李紹輝1，蔣受軍2，姚美伊1，李紅娜1，鄭 陽1，張 峰1,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100123；2.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530299）

通過正交試驗分析法對肉制品中梔子黃色素提取方法進行優化。利用正交試驗設計考察提取溶劑體積、超聲時間和提取次數對肉制品中梔子黃色素提取回收率的影響。 結果表明，肉制品中梔子黃色素的最優提取條件為：甲醇為提取溶劑、固液比1∶6（g/mL）、超聲提取時間20 min、提取2 次；建立高效液相色譜法測定肉制品中梔子黃色素中藏花素和藏花酸方法的線性范圍為0.5～50 mg/mL，相關系數大于0.999，檢出限不高于0.07 μg/g，加標平均回收率為83.51%～96.00%，相對標準偏差不大于2.94%。該方法準確度高、簡單、快速，可適用于肉制品中梔子黃色素中藏花素和藏花酸含量檢測。

高效液相色譜法；正交試驗；肉制品；藏花素；藏花酸；梔子黃

隨著社會的發展和人民生活水平的提高，食品添加劑的安全問題越來越受到人們重視，也逐漸成為我國重要的食品安全問題[1-3]。2002年，我國食品工業“十五”發展規劃中表明我國食品添加劑發展的方向是天然、營養、多功能且安全可靠等。著色劑作為是食品添加劑中重要一員，受到了關注[4-7]。其可分為食用合成色素和食用天然色素[8]，食用合成色素雖具備顏色鮮艷，種類多樣等優點，但其毒害作用不容忽視，許多國家都限制或禁止其使用[9-11]，使其應用受到限制[12]，而天然色素具有天然無毒害的特點，越來越受歡迎[13-14]。

梔子黃色素是自然界罕見的水溶性類胡蘿卜天然色素，其主要有效成分是藏花素和藏花酸[15]。其有清熱祛火，涼血利膽，降低膽固醇，安全無毒等作用，是一種集著色、營養、保健多功能為一體的食用植物色素[16]。日本和我國在許多食品中都已添加了梔子黃色素[17-19]，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中也規定了梔子黃的最大使用量，但目前對食品中梔子黃的檢測方法的研究較少且過去往往認為梔子苷是梔子黃的主要成分，以梔子苷為對照品檢測食品中梔子黃含量[20-21]，但GB/T 7912—2010《食品添加劑梔子黃》中規定了梔子黃的主要成分是藏花素和藏花酸，以梔子苷為主成分是不夠合理的，所以食品中梔子黃含量測定存在不同意見[22-25]。為了有效控制食品中梔子黃的用量，本實驗選擇以藏花素和藏花酸為對照品，建立高效液相色譜分析方法，以監測市場食品中梔子黃色素的用量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏花素、藏花酸（純度98.0%） 美國Chroma DEX公司；乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；乙酸（色譜純） 西隴化工有限公司；0.22 μm濾膜 天津津隆公司；鹽焗雞熟肉制品（含梔子黃） 香河正大有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-30AD高效液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測、SIL-30AC自動進樣器 日本島津公司；R-134A旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；KQ-500DE超聲儀 昆山市超聲儀有限公司；十萬分之一電子天平 美國Mettler Toledo公司；高速臺式冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；Muti Shaker Mms振蕩儀 日本Tokyo Rirakikai公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取藏花素和藏花酸各5.0 mg，分別置于50 mL的棕色容量瓶中，甲醇定容，配成0.1 mg/mL儲備液，并在18 ℃保存待用。

1.3.2 標準曲線的繪制

準確移取適量藏花素和藏花酸儲備標準溶液到10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋，配成藏花素和藏花酸的一系列標準曲線的質量濃度為0.5、1、2、5、10、20、50 μg/mL溶液，在優化后的色譜條件下測定，以各物質的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 色譜條件優化所用基本前處理方法

鹽焗雞樣品切成小塊后均質，準確稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，用30 mL甲醇提取，超聲20 min（500 W、40 kHz），離心10 min（轉速為5 000 r/min）后，取出上清液，再用30 mL上述提取溶劑和提取殘渣，合并提取液并混勻，旋轉蒸發儀濃縮至10 mL，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜測定。

1.3.3.2 樣品提取方式比較

比較超聲與振蕩的提取方式。將鹽焗雞熟肉制品切成小塊后均質，準確稱取5.00 g，平行取12 份，用30 mL甲醇溶解樣品，其中6 份超聲30 min（功率500 W，頻率40 kHz）；另外6 份樣品振蕩30 min；12 份樣品離心10 min（轉速10 000 r/min），取出上清液，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜測定。

1.3.3.3 提取溶劑比較

實驗考察水、甲醇、乙醇溶劑對樣品中梔子黃提取效率的影響。鹽焗雞熟肉制品切成小塊后均質，準確稱取5.00 g，平行取18 份，分別用30 mL水、甲醇和乙醇溶解樣品，各6 份，超聲30 min（功率500 W，頻率40 kHz），離心10 min（轉速10 000 r/min），取出上清液，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜測定。

1.3.3.4 單因素及正交試驗

采用單因素試驗考察甲醇提取溶劑的體積、超聲時間和提取次數對鹽焗雞樣品中的梔子黃提取量的影響。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

采用L9（34）正交試驗表，考察三因素三水平的最佳組合，以獲得肉制品中梔子黃的最佳提取條件。正交試驗樣品采用加標樣品。在5.00 g空白樣品中分別加入0.5 mL 0.1 mg/mL藏花素和藏花酸儲備液，根據正交試驗表1方案處理樣品，采用高效液相色譜檢測，并計算提取回收率，公式如下：

式中：C1為藏花素和藏花酸高效液相色譜測定并計算所得質量濃度；C2為藏花素和藏花酸理論質量濃度5 μg/mL。

1.3.4 色譜條件

Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.003%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0.0～1.0 min，20% A；1.0～8.0 min，20%～60% A；8.0～8.1 min，60%～70% A；8.10～13.0 min，70%～98% A；13.0～15.0 min，98%～20% A；15.0～20.0 min，20% A）；流速1.0 mL/min；檢測波長442（藏花素）、425 nm（藏花酸）；進樣量10 μL；柱溫為常溫。

1.3.5 加標回收率實驗

取鹽焗雞肉制樣品（含梔子黃）18 份，每份5.00 g，加入低、中、高混合標品，各6 份，按照1.3.3節的樣品前處理方法處理樣品，進行加標回收率實驗。

1.3.6 精密度、重復性和穩定性實驗

精密度實驗：精密移取1 mL 10 μg/mL的混合標品，按照1.3.4節色譜條件重復進樣6 次，分別以藏花素和藏花酸的峰面積為對象，計算其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以考察色譜儀器的精密度。

重復性實驗：取同一鹽焗雞樣品6 份，每份5.00 g，按照1.3.3節處理樣品，按照1.3.4節色譜條件測定藏花素和藏花酸的峰面積，并計算RSD。

穩定性實驗：取一鹽焗雞樣品5.0 g，按照1.3.3節處理樣品后，分別在0、2、4、6、8 h進樣測定，藏花素和藏花酸的峰面積，并計算RSD。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

圖1 藏花素（A）、藏花酸（B）光譜圖Fig.1 UV scanning spectra of crocin (A) and crocetion (B)

本實驗考察了最大吸收波長、流動相組成和梯度洗脫條件。對藏花素和藏花酸標準溶液進行掃描，結果顯示藏花素在波長442 nm處有最大吸收，藏花酸在波長425 nm處有最大吸收，如圖1所示。比較了流動相甲醇-水溶液、甲醇-0.003%乙酸溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.003%乙酸溶液的色譜峰形和響應，結果顯示乙腈-0.003%乙酸溶液比甲醇-0.003%乙酸溶液峰形好，比乙腈-水溶液響應高，酸可以增強響應，提高檢測的靈敏度，結果采用乙腈-0.003%乙酸溶液作為流動相。實驗通過1.3.4節梯度洗脫條件，使藏花素和藏花酸獲得良好的分離度。

在1.3.3.1節前處理方法和1.3.4節的色譜條件下，分別測定了空白溶劑，混標溶液和鹽焗雞樣品色譜圖，如圖2所示。色譜圖在15 min內完成出峰，分離度好，專屬性強。

圖2 梔子黃的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank sample, gardenia yellow standard and salt-roasted chicken

2.2 前處理方法的優化

2.2.1 提取方式的選擇

圖3 提取方式的比較Fig.3 Comparison of two extraction methods

超聲對梔子黃色素的提取效率比振蕩的高一些，結果如圖3所示。可能是因為超聲的空化作用更有利于梔子黃色素溶于甲醇溶劑中，所以結果采用超聲提取樣品。

2.2.2 提取溶劑的選擇

圖4 提取溶劑的選擇Fig.4 selection of optimal extraction solvent

圖4結果顯示，甲醇更有利于藏花素的提取，乙醇更有利于藏花酸的提取。但梔子黃的提取量是由藏花素和藏花酸的提取量推算而得，甲醇同時提取兩者效率比乙醇更優，所以采用甲醇溶液提取鹽焗雞肉制品中的梔子黃。

2.2.3 單因素試驗的考察

圖5 各因素對梔子黃提取量的影響Fig.5 Effect of extraction conditions on the content of crocetion analyzed by one-factor-at-a-time design

如圖5所示，甲醇提取溶劑體積40 mL，超聲時間40 min，提取5 次，梔子黃的提取量達最高。

2.2.4 正交試驗優化

從表2可以看出，RA＞RC＞RB，3 個因素對鹽焗雞肉制品中的梔子黃提取回收率的影響大小依次是甲醇體積＞提取次數＞超聲時間。正交試驗得出的最優提取工藝是A3B2C3。3 個因素中，甲醇提取溶液體積因素影響最為顯著。綜合考慮試驗時間和強度，優化的提取條件選為A3B1C2，即甲醇提取溶液體積30 mL，超聲時間20 min，提取次數2 次。

表2 L9（34）正交試驗設計及結果Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

2.3 驗證實驗

按A3B1C2條件進行3 次平行實驗，肉制品中的梔子黃提取回收率為93.65%，高于表2中的每項實驗，故選擇A3B1C2為最佳提取工藝條件。

2.4 凈化方式的優化

本實驗對比了液液萃取、固相萃取，溶劑萃取的凈化方式。鹽焗雞熟肉制品切成小塊均質，準確稱取5.00 g，平行取18 份，加入30 mL甲醇溶液，超聲30 min（功率500 W，頻率40 kHz），離心10 min（轉速10 000 r/min），取出上清液。取6 份上清液加入等體積的正己烷液液萃取脫脂取上清液，用旋轉蒸發儀濃縮，用2 mL甲醇溶解過膜，待測；取6 份上清液通過HLB固相萃取柱凈化，分別用5 mL水和甲醇依次活化后上樣，用5 mL甲醇洗脫，洗脫液氮吹干后用2 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜測定；取6 份甲醇提取后的殘渣再用30 mL的甲醇溶劑萃取渦旋10 min后，離心10 min（轉速10 000 r/min），合并提取液后用旋轉蒸發儀濃縮，殘渣定容至10 mL后過膜，待高效液相色譜測定。通過液液萃取、固相萃取和溶劑萃取的凈化方式的比較，測得藏花素平均含量為6.23、5.52、10.46 μg/g；藏花酸的平均含量為11.45、9.89、20.69 μg/g。在色譜圖上分析，3 種凈化方式都避免了雜質的干擾，而用甲醇溶劑萃取能夠保證較高而穩定的回收率。所以選擇甲醇溶劑萃取。

2.5 線性關系的考察

在1.3.4節色譜條件下，對系列質量濃度的混標溶液進行檢測，將標準溶液逐步稀釋至其響應值為噪音的3 倍（即信噪比為3∶1）所對應的溶液質量濃度為檢出限。同時將加標樣品經1.3.3節前處理，測得響應值為噪音的10 倍（即信噪比10∶1）所對應的溶液質量濃度為方法定量限。其回歸方程、相對系數、線性范圍、檢出限和定量限結果見表3。由表3可知，該方法線性良好，檢出限和定量限符合國家標準食品添加劑的殘留檢測要求。

表3 藏花素和藏花酸回歸方程、檢測限和定量限Table 3 Regression equations, limits of detection and limits ofquantitation for crocin and crocetion

2.6 加標回收率考察

如表4所示，樣品中藏花素和藏花酸的回收率在83.51%～96.00%間，回收率良好，該方法具有可行性。

表4 加標回收率考察TTable 4 Recovery rates of crocin and crocetion fromspiked real sample

2.7 精密度、重復性和穩定性考察

精密度實驗結果表明，藏花素和藏花酸的RSD分別為0.04%和0.12%，可以看出儀器具有較高的精密度。

重復性實驗結果表明，藏花素峰面積的RSD（n=6）為1.28%；測得藏花酸峰面積的RSD（n=6）為1.68%，說明該方法重復性良好。

穩定性實驗結果表明，分別測得藏花素和藏花酸峰面積的RSD（n=6）為2.21%和1.86%，可見在8 h內穩定性良好。

2.8 樣品的測定

表5 6個批次的鹽焗肉制品梔子黃色素含量Table 5 Contents of gardenia yellow in six batches of salt-roasted chicken

6 個批次的鹽焗雞樣品的測定結果如表5所示，根據我國食品添加劑使用標準規定肉制品中梔子黃的最大使用量為1 500 μg/g。由結果可知，6 個批次的鹽焗雞肉制樣品中藏花素和藏花酸的含量之和遠小于我國食品添加劑使用標準規定肉制品中梔子黃的最大使用量，可推測6 個批次的鹽焗雞肉制品中梔子黃的含量符合標準。

3 結 論

本實驗通過正交試驗得出肉制品中梔子黃的最優提取條件為甲醇溶劑體積為30 mL、超聲提取時間20 min、提取2 次，并采用Agilent Extent-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.003%乙酸溶液（梯度洗脫），流速1.0 mL/min，藏花素和藏花酸檢測波長分別為442 nm和425 nm。結果表明藏花素和藏花酸在15 min內出峰，分離效果好，線性范圍為0.5～50 mg/mL，相關系數大于0.999，平均回收率為83.51%～96.00%，RSD為1.23%～2.94%，檢出限不高于0.07 μg/g，最終建立了一種準確、簡單、快速的高效液相色譜法測定肉制品中藏花素和藏花酸的含量，為今后測定食品中的梔子黃提供有益的參考。

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Determination of Gardenia Yellow in Meat Products by High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Wei’e1,2, LING Yun1, ZHANG Yuan1, LI Shaohui1, JIANG Shoujun2, YAO Meiyi1, LI Hongna1, ZHENG Yang1, ZHANG Feng1,*
(1. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China; 2. College of Pharmacy, Guangxi University of Traditional Chinese Med icine, Nanning 530299, China)

With the aim of developing an optimal sample preparation method for the determination of gardenia yellow in meat products by high performance liquid chromatography (HPLC), orthogonal design methodology was employed to optimize the recovery rate of gardenia yellow from samples with respect to four extraction conditions including solid/solvent ratio (g/mL), ultrasonic extraction time and extraction number. The optimal extraction conditions were achieve d as follows: samples were ultrasonically extracted twice for 20 min each using methanol with a solid/solvent ratio of 1:6 (g/mL). The HPLC method established based on these optimized extraction conditions exhibited a good linear relationship in the range from 0.5 to 50 mg/mL with correlation coefficient of higher than 0.999 and a detection limit of 0.07 μg/g for crocin and crocetion in meat products. The mean spike recovery rates for both gardenia yellows in meat products were in the range of 83.51%–96.00% with a relative standard deviation (RSD) of 2.94%. This method is accurate, simple, quick and suitable for the determination of crocin and crocetion in meat products.

high performance liquid chromatography; orthogonal experiment; meat; crocin; crocetion; gardenia yellow

10.7506/spkx1002-6630-201602033

O657.72

A

1002-6630（2016）02-0187-06

周偉娥, 凌云, 張元, 等. 高效液相色譜法測定肉制品中梔子黃色素含量[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 187-192. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602033. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Wei’e, LING Yun, ZHANG Yuan, et al. Determination of gardenia yellow in meat products by high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(2): 187-192. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602033. http://www.spkx.net.cn

2015-04-26

國家重大科學儀器設備開發專項（2012YQ14000806）；北京市科技計劃課題（2141100002614020）；國家質檢總局科技計劃項目（2013K202）；調味品中添加劑及非食品添加物質的系統篩查及確證方法研究項目（2013IK198）

周偉娥（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品藥品分析和安全性評價。E-mail：824047422@qq.com

*通信作者：張峰（1974—），男，研究員，博士，研究方向為分析化學。E-mail：fengzhang@126.com