復(fù)方清熱瀉火湯活性成分提取工藝研究

陳 勇，王紹紅

(荊州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，湖北荊州434000)

樓一層

(武漢理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院， 湖北武漢430070)

“復(fù)方清熱瀉火湯”來(lái)源《會(huì)約》卷六加減，在醫(yī)院臨床應(yīng)用多年。其中生地為玄參科多年生草本植物地黃 (Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鮮或干燥的塊根［1］，有清熱涼血、益陰生津之功效［2］。李時(shí)珍對(duì)生地黃的評(píng)價(jià)是:“服之百日面如桃花，三年輕身不老”［3］。大黃為蓼科 (Polygonaceae)屬多年生草本，根狀莖及根供藥用［4］，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效。用于實(shí)熱便秘、積滯腹痛、濕熱黃疸、血熱吐衄、腸癰腹痛。復(fù)方清熱瀉火湯以生地、大黃為君藥，配以白芷、黃芩、赤芍、防風(fēng)、獨(dú)活、甘草等6味藥，具有清熱涼血、涼血祛瘀等功效，臨床上可用于治療各種熱血毒盛、發(fā)斑發(fā)疹、熱毒癰瘍等癥狀［5］。采用高效液相色譜法對(duì)中藥中的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定已成為中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和優(yōu)化提取工藝的重要手段［6］。本文研究了不同提取方法對(duì)復(fù)方清熱瀉火湯中有效成分的影響，并對(duì)最佳的提取方法進(jìn)行了正交試驗(yàn)的優(yōu)化，找出影響因素，確定最優(yōu)的提取工藝［7］。從整體上為復(fù)方清熱瀉火湯的有效活性成分提取工藝建立客觀、有效的方法，并為復(fù)方清熱瀉火湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 1525 Binary HPLCpump(美國(guó)waters公司);Waters 2998 photodiode Array Detector(美國(guó)waters公司)。AT20型分析天平 (十萬(wàn)分之一)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮科技有限公司)。KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。甲醇等為色譜純 (Tedia公司，美國(guó))，制樣所用試劑均為分析純。液相用水為三次重蒸水，大黃素對(duì)照品 (中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào):110756-200110)。復(fù)方清熱瀉火湯藥材 (生地、大黃、白芷、黃芩、赤芍、防風(fēng)、獨(dú)活、甘草)均購(gòu)自安徽亳州中藥材公司，經(jīng)武漢理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院樓一層教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 ZORBAXC18(250mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫:30℃，流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液 (80:20)，流速:1.0ml/min，進(jìn)樣量:20μl［8］。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24h的大黃素對(duì)照品25mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加甲醇定容，制成每1ml含500μg的溶液，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取2.1.2中配制好的大黃素標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0，4.0、6.0、8.0、10.0ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置。即得不同濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20μl，于254nm波長(zhǎng)處，測(cè)定峰面積，大黃素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖1。以峰面積(y)對(duì)溶液濃度(x)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果回歸方程為:y=38002x+20866，r=0.9999。大黃素在50～500μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，大黃素對(duì)照品濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1 大黃素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 大黃素對(duì)照品濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.4 試樣中大黃素的測(cè)定 取粗提取物一定量于50ml容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，依次加入試劑，定容，再取1ml樣品溶液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，進(jìn)樣20μl，于254nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，計(jì)算大黃素的含量，液相圖譜見圖3。

圖3 復(fù)方清熱瀉火湯供試品液相色譜圖

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一大黃素對(duì)照品溶液，在最大吸收波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到大黃素的含量，結(jié)果表明RSD為0.65%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液6份，分別進(jìn)樣20μl，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果表明RSD=1.03%(n=6)，表明供試品溶液重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液在0、2、4、6、8、12、24h分別進(jìn)樣20μl，記錄峰面積，結(jié)果表明RSD為0.97%(n=6)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.8 回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取同一方法制備的已知大黃素含量的供試品溶液6份，每份加入對(duì)照品溶液1ml，測(cè)定大黃素的含量。計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.56%，RSD為1.24%(n=6)。

2.2 提取方法

2.2.1 索氏提取法 準(zhǔn)確稱取復(fù)方清熱瀉火湯處方藥材28g粉碎使成粗粉，用濾紙包好，放入索氏提取器中，用80%乙醇提取，直至回流液無(wú)色，回收溶劑，烘干得到粗提物，分析產(chǎn)品并測(cè)定大黃素的含量［9］，所得大黃素的得率及數(shù)據(jù)見表1。

表1 索氏提取法提取復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素的得率

2.2.2 超聲波提取法 準(zhǔn)確稱取復(fù)方清熱瀉火湯處方藥材28g粉碎使成粗粉，加入280ml的80%乙醇溶液，超聲提取 (功率250W，頻率40kHz)40min，回收溶劑，烘干得到粗提物，分析產(chǎn)品并測(cè)定大黃素的含量，所得大黃素的得率及數(shù)據(jù)見表2。

表2 超聲提取法提取復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素的得率

2.2.3 乙醇回流提取法 準(zhǔn)確稱取復(fù)方清熱瀉火湯處方藥材28g粉碎使成粗粉，置于圓底燒瓶中，加入280ml的80%乙醇，置于電熱套上進(jìn)行回流提取1.5h，過(guò)濾，回收溶劑，烘干得到粗提物，分析產(chǎn)品并測(cè)定大黃素的含量，所得大黃素的得率及數(shù)據(jù)見表3。

表3 乙醇回流法提取復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素的得率

2.3 乙醇回流法正交提取試驗(yàn)

表4 乙醇回流提取法正交試驗(yàn)因素水平表

表5 乙醇回流提取法提取復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素正交試驗(yàn)結(jié)果

以大黃素的得率為主要考查指標(biāo)，粗提取物的質(zhì)量為參考指標(biāo)，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)［10］。考查影響因素:乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)復(fù)方清熱瀉火湯活性成分中大黃素提取的影響。由文中表4、表5可知，A因素 (乙醇濃度)對(duì)大黃素的得率影響最大，隨著提取乙醇濃度的升高而增大，D因素 (提取次數(shù))其次，B因素 (乙醇用量)和C因素 (提取時(shí)間)對(duì)大黃素的得率影響最小，結(jié)合提取效率與成本考慮，故綜合確定最佳的提取方案為:A3B2C1D3，即乙醇濃度85%，乙醇用量為藥材的10倍量，提取時(shí)間為1h，提取次數(shù)為3次。

3 結(jié) 論

不同的提取方法對(duì)復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素的提取效果比較結(jié)果表明，乙醇回流提取得率(0.65%)＞超聲提取法 (0.60%)＞索氏提取法 (0.56%)。乙醇回流提取法的得率高于其余兩種方法，所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方法成熟易行，相比之下，乙醇回流提取法提取復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素的方法是最佳的選擇。

使用乙醇回流提取法提取大黃素時(shí)，提取所用的乙醇濃度對(duì)大黃素得率的影響最大，其次為提取次數(shù)、乙醇用量和提取時(shí)間。乙醇回流提取法提取復(fù)方清熱瀉火湯中大黃素的適宜工藝條件為:提取所用乙醇濃度為85%，乙醇用量為10倍量的藥材量，提取1h，提取3次。在此工藝條件下，大黃素提取物的得率可達(dá)到0.67%。

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