婆羅雙樹樣基因4在人前列腺癌細胞和組織中的表達及其與臨床預后之間的關系*

賴義明， 黃 海， 凌逸虹， 曾樂祥， 陳杰青， 曹 億，余永晟， 張思敏， 張一鳴， 李 金， 王淦平， 郭正輝△

(中山大學孫逸仙紀念醫院1泌尿外科，3小兒外科，5急診外科，廣東廣州510120;2中山大學腫瘤防治中心病理科，廣州510060;4深圳市第二人民醫院泌尿外科，廣東深圳518035;6增城市人民醫院泌尿外科，廣東廣州511300)

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在世界范圍內逐年增加［1］。前列腺癌早期無明顯癥狀，大部分患者在發現時已是晚期，錯失最佳的治療時機，因此，尋找具有高度靈敏性和特異性的前列腺癌腫瘤標記物很有必要。婆羅雙樹基因(Spalt，SAL)最早在果蠅中發現，在果蠅的生長發育中發揮著重要作用［2］。婆羅雙樹樣基因 4(Sal-like 4，SALL4)是SAL的4個人類同源異型基因之一，其編碼的蛋白包含多個C2H2雙鋅指結構域(zinc finger，ZF)，是一種廣泛表達的轉錄因子。近年來的研究發現SALL4蛋白在胚胎干細胞的干性維持、自我更新及快速增殖過程中發揮著重要的調控作用［3］，SALL4表達對于生殖細胞腫瘤、急性髓性白血病、骨髓增生異常綜合征、乳腺癌及肺癌等腫瘤的診斷具有重要的臨床意義［4-8］。目前，國內外尚未有關于SALL4在前列腺癌中的相關研究，其在正常前列腺以及前列腺癌組織中的表達情況尚不清楚。本研究通過前列腺癌細胞系、良性增生前列腺和前列腺癌組織切片，應用間接免疫熒光、RT-PCR、Western blotting和免疫組化的方法，探討SALL4蛋白在前列腺癌中的表達情況，并闡明其和臨床病理學參數之間的關系。

材料和方法

1 材料

1．1 主要試劑 RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒和RT-PCR試劑盒購自TaKaRa。SALL4兔抗人多克隆抗體購自Abcam。免疫組織化學的工作濃度為1∶50，采用北京中杉金橋生物技術有限公司的免疫組化試劑。Dylight 488標記的山羊抗兔IgG購自杭州聯科生物技術有限公司。其它試劑購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1．2 前列腺癌細胞系及組織標本 (1)人前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細胞系由中山大學孫逸仙紀念醫院林百欣醫學研究中心獲得。(2)前列腺石蠟標本為2007～2012年中山大學孫逸仙紀念醫院泌尿外科手術標本。其中前列腺癌組織68例，前列腺增生組織30例，正常前列腺組織采用內對照共68例，年齡(66．5±8．1)歲，所有標本均為初發，術前未做任何治療，術后均由甲醛固定，石蠟包埋保存。標本均由中山大學孫逸仙紀念醫院病理科提供。

2 方法

2．1 免疫熒光染色法 將處于對數生長期的LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細胞接種于24孔培養板，于37℃、5%CO2孵箱內培養24 h，用PBS洗3次;用4%多聚甲醛和0．1%Triton X-100固定通透各30 min，PBS洗3次;用1% 牛血清白蛋白室溫封閉1 h;加入SALL4兔抗人多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜后用PBS洗3次，同時用正常兔血清代替Ⅰ抗作為對照同法進行反應，用來驗證兔抗人SALL4抗體的特異性;加入1∶100稀釋的 Dylight 488-山羊抗兔IgG，于室溫搖床孵育1 h，PBS洗3次;DAPI(1∶1 000)復染核1 min，PBS 洗3 次，熒光顯微鏡觀察結果。

2．2 RT-PCR檢測前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細胞系中SALL4 mRNA的表達 取 LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細胞培養瓶加入RNAiso Plus 1 mL，待細胞徹底勻漿后轉移至1．5 mL EP管，按RNAiso Plus說明書提取細胞總RNA。提取后溶于去離子水中，測量RNA含量。取上述各樣本總RNA各1μg，按25μL體系進行反轉錄反應，反應條件為:37℃ 15 min，85℃5 s，4℃ 1 s。PCR 引物由 Invitrogen合成，SALL4引物序列為:正義鏈 5’-CCCGGCAGTAAGGACTGTC-3’，反義鏈 5’-TCTCTGTCTTTAGGTACACCACA-3’。PCR產物為97 bp，PCR反應體系:98℃ 10 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共32個循環。RT-PCR產物的半定量分析:瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。應用凝膠圖像掃描系統對擴增產物的電泳條帶進行吸光度掃描，計算出SALL4與GAPDH的吸光度(A)比值，結果以SALL4/GAPDH表示。

2．3 Western blotting法檢測前列腺癌 LNCaP、DU145和PC-3細胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細胞系中SALL4蛋白的表達 向細胞加入含有PMSF的 RIPA裂解液，冰上裂解 30 min。4℃、12 000 r/min離心30 min，將上清移至新的EP管。然后對所得的蛋白液進行BCA法測濃度。配制8%分離膠和5%濃縮膠，按每孔50μg的上樣量恒壓電泳。然后將蛋白電轉到PVDF膜后，用5%脫脂奶粉封閉。將目的條帶孵育在 GAPDH(1∶1 000，碧云天)和SALL4(1∶800，Abcam)Ⅰ抗稀釋液中4℃過夜。第2天再孵育Ⅱ抗1 h，然后用超敏ECL發光液(Millipore)及黑白膠片(柯達)進行曝光。

2．4 免疫組化染色檢測前列腺組織中SALL4蛋白的表達 前列腺癌和增生前列腺組織4 mm厚石蠟切片，二甲苯脫蠟10 min×2，梯度乙醇水化。將切片浸入3%過氧化氫，避光作用10 min，PBS洗片3次，將切片放入檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液(碧云天)塑料盒中，微波爐抗原修復21 min(高火7 min，中火14 min)，冷卻至室溫。PBS洗片2次，擦凈周圍水分，滴加第Ⅰ抗體，濕盒內4℃ 孵育過夜，PBS洗片2次。擦凈周圍水分，滴加Ⅱ抗，濕盒內室溫30 min，PBS洗片2次。擦凈周圍水分，滴加DAB顯色劑(中杉金橋)，3～5 min后顯微鏡觀察染色的效果，自來水終止反應。擦凈周圍水分，滴加蘇木素(1∶20，中杉金橋)染核5 min，自來水終止反應。光學顯微鏡下讀片，記錄染色強度，封固。SALL4陽性染色標準:染色均勻，呈棕色顆粒樣。對染色結果進行半定量判定:染色強度依次為0分(無色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色);染色范圍以染色細胞所占的百分比評分:陽性細胞＜25%為0分，25% ～50%為1分，51% ～75%為2分，＞75%為3分。染色強度和陽性細胞百分比的乘積為免疫組化的結果:0分判斷為(－)，1分和2分判斷為(+)，3分和4分判斷為(++)，6分和 9分判斷為(+++)。

3 統計學處理

應用SPSS 17．0統計軟件分析，計數資料采用卡方檢驗，等級資料采用秩和檢驗，計量資料數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 LNCaP、DU145、PC-3 和 RWPE-1 細胞中SALL4的定位分析

用兔抗人SALL4抗體作為Ⅰ抗建立間接細胞免疫熒光法，對 LNCaP、DU145、PC-3和 RWPE-1細胞中SALL4蛋白的表達分布進行檢測，結果顯示，RWPE-1細胞中SALL4含量較低，熒光顯微鏡下只見微弱熒光;LNCaP、DU145和PC-3細胞內SALL4表達量較RWPE-1細胞顯著增強，且主要分布在細胞漿內，胞核和胞膜也有少量表達，見圖1。用PBS代替Ⅰ抗作為對照，按同法與上述4種細胞進行反應，熒光顯微鏡下均未見細胞出現熒光。

2 RT-PCR檢測前列腺癌細胞系及正常前列腺細胞SALL4 mRNA的表達

由圖2可見，目標基因及內參照條帶清晰，比例正確。A260/A280分別為 1．895、1．955、1．926 和1.885，RNA質量滿意。被擴增的2條DNA片段分別為 SALL4和GAPDH。SALL4 mRNA在RWPE-1、LNCaP、DU145和PC-3細胞中均有表達，表達水平無明顯差異(P ＞0．05)。

3 Western blotting檢測前列腺癌細胞系及正常前列腺細胞SALL4蛋白的表達

從圖3中可以看出3種前列腺癌細胞中SALL4蛋白的表達量要明顯高于正常前列腺上皮細胞，差異均有統計學意義(P＜0．05)。

4 免疫組化染色檢測前列腺癌、前列腺增生及正常前列腺組織中SALL4蛋白的表達

染色結果顯示，陽性染色僅見于前列腺癌上皮細胞及部分增生前列腺上皮細胞和少量正常前列腺上皮細胞，前列腺癌基底細胞、間質細胞均未見陽性染色，見圖4。SALL4在前列腺癌組織中的蛋白表達水平明顯高于增生前列腺和正常前列腺(P＜0．01)，而在正常前列腺和增生前列腺間的表達水平無顯著差異，見表1。SALL4表達水平與Gleason評分、前列腺癌臨床分期、預后及組織前列腺特異抗原(prostatespecific antigen，PSA)表達密切相關;而與患者年齡、治療前血清總PSA水平、前列腺體積及組織雄激素受體(androgen receptor，AR)表達無明顯相關性，見表2。

Figure 1．Intracellular distribution of SALL4 in LNCaP，DU145，PC-3 and RWPE-1 cells detected by immunofluorescence(×400)．圖1 免疫熒光染色法檢測LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細胞中SALL4的表達分布

Figure 2．Expression of SALL4 mRNA in prostate cancer cell lines LNCaP，DU145 and PC-3，and normal prostate epithelial cell line RWPE-1．M:marker;1:RWPE-1;2:LNCaP;3:DU145;4:PC-3;5:RWPE-1;6:LNCaP;7:DU145;8:PC-3．圖2 前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細胞系SALL4 mRNA的表達

Figure 3．The expression of SALL4 proteins in prostate cancer cell lines LNCaP，DU145 and PC-3，and normal prostate epithelial cell line RWPE-1 was evaluated by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0．05 vs LNCaP，DU145 and PC-3 cells．圖3 前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3細胞系以及正常前列腺上皮RWPE-1細胞系SALL4蛋白的表達

Figure 4．Expression of SALL4 protein in prostate tissues(immunohistochemistry，× 400)．A:cancerous prostate tissues，SALL4 was located in the cytoplasm and part of it in the nucleus;B:hyperplastic prostate tissues，both cytoplasm and nucleus were negative;C:normal prostate tissues，both cytoplasm and nucleus were negative;D:negative control．圖4 SALL4蛋白在前列腺組織中表達

表1 前列腺癌、增生前列腺和正常前列腺組織SALL4染色結果Table 1．Positive staining of SALL4 in cancerous，hyperplastic and normal prostate tissues

表2 68例前列腺癌病理組織的臨床病理資料與SALL4蛋白表達的相關分析Table 2．Correlation of the SALL4 expression with the clinicopathologic features of 68 prostate cancer cases

討 論

前列腺癌的生物學行為和病理組織形態均較為復雜，單純地依靠任何一種常規的病理學觀察或臨床檢查結果來判斷前列腺癌患者病情的惡性程度和預后常存在一定的困難和偏差，常引起漏診、誤診。PSA作為前列腺癌標記物被廣泛應用于前列腺癌的篩查，但是很多良性前列腺疾病以及包括直腸指診、前列腺穿刺活檢等在內的多種常規檢查方法均可導致血清PSA水平的升高，這嚴重影響了PSA單獨用于診斷前列腺癌的準確性。懷疑前列腺癌，治療前血清PSA在4．0～10．0μg/L范圍內，行穿刺活檢的患者約有高達75%被證實為非癌［9］。尋求新的高靈敏性和特異性的前列腺癌腫瘤標記物顯得迫切而且非常重要。前列腺癌的基礎研究表明，多種基因及相關分子共同參與了前列腺癌的發生、發展，其中SALL4基因是SALL家族成員之一，定位于人染色體20q13．13 ～ 13．2。SALL 基 因 家 族 包 括 SALL1 到SALL4 4個成員，最早克隆于與果蠅同源的DNA序列(Sal)［2］。Sal是果蠅生長發育必須的同源異構基因［10］。人類SALL基因家族與人的正常生長發育密切相關［11］。

SALL4包含4個外顯子，由于外顯子2內部拼接模式的不同，其可以編碼SALL4A和SALL4B 2種異構體蛋白。SALL4A和SALL4B表達廣泛且具有組織特異性，可見于腦、肺、腎、睪丸、卵巢和CD34+細胞，但后者不表達于 CD34+細胞［5］。SALL4A 和SALL4B能夠形成同質或異質二聚體，并在早期胚胎發育中發揮重要作用［12］。SALL4A和SALL4B雖然有許多相似的結構，但它們也有不完全相同的結合位點，它們可以與不同的干性因子相互作用，在小鼠胚胎干細胞中僅需SALL4B的存在就可以維持其多能狀態［13］。在人類中，SALL4的缺失或突變與多種疾病相關，包括Okihiro綜合征、acro-renal-ocular綜合征和IVIC綜合征，這些疾病均以多器官畸形為特征，如耳畸形、聽力喪失以及肢體、心臟和腎臟等臟器的缺陷等［14-16］。與許多胚胎干性因子不同，SALL4可以在成體干細胞尤其是造血前體細胞中表達，SALL4可以通過下游的Bmi-1調節造血細胞的生長［17］。SALL4的過度表達能促進造血干/祖細胞的增殖和維持自我更新［18］。SALL4調控干細胞命運和造血干/祖細胞自我更新的功能可能與表觀遺傳機制有關［19］。

本研究結果顯示SALL4蛋白在細胞中主要表達于胞漿，在胞核中也有微量表達，在3種前列腺癌細胞株中SALL4的蛋白表達水平均要明顯高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1(P＜0．05)，而SALL4 mRNA的表達水平在4種細胞系中無明顯差異(P＞0．05)，說明SALL4可能主要在蛋白水平起作用。免疫組化結果顯示正常前列腺與前列腺增生組織中SALL4陽性表達分別為22．06%和23．33%，而在前列腺癌中有接近95．6%的標本 SALL4陽性表達顯著增高(P＜0．01)，而且其陽性表達強度與 Gleason評分、臨床分期、預后及組織中PSA的表達密切相關。有類似的研究表明SALL4過表達于不同的惡性腫瘤，在結直腸癌中，大約90%的腫瘤標本有SALL4過表達，并且與腫瘤淋巴結轉移及分化程度密切相關［20］，在乳腺癌中也有86．1%的腫瘤SALL4表達增高，甚至在腫瘤的早期就可以增高［7］。此外，有研究發現93%的肺癌有 SALL4 表達水平的增高［8］。Cao等［4］的研究表明在所有類型的睪丸生殖細胞腫瘤中，SALL4是維持腫瘤低分化狀態所必須的。另外，SALL4也表達于超過90%的轉移性精原細胞瘤、未成熟型畸胎瘤、胚胎性癌，SALL4可作為睪丸、卵巢和性腺外轉移性生殖細胞腫瘤一種新的診斷標志物［21］。目前有研究表明 SALL4 與 Wnt、PTEN、NFКB及凋亡等信號通路密切相關，如在結直腸癌中，SALL4過表達可以通過轉錄抑制促凋亡基因PTEN而抑制腫瘤細胞凋亡，并且通過表觀遺傳修飾Bmi-1使上皮細胞分化基因持續受到抑制，引起結直腸癌細胞發生上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)喪失黏附性而促進其轉移到淋巴結中［20］。在乳腺癌中，SALL4可抑制黏附基因CDH1并且上調CDH1抑制基因ZEB1，從而促進乳腺癌的轉移［22］。我們前期研究發現前列腺特異性膜抗原可能通過上調ERK蛋白的活性正向調節前列腺癌細胞的生長、遷移，進一步檢測發現不同情況下ERK與SALL4的表達具有高度的一致性，磷酸化的ERK可能通過進入胞內激活SALL4啟動腫瘤細胞快速增殖機制［23-24］。這些研究提示在前列腺癌中SALL4表達的增高也可能通過上述信號通路起作用。

本研究在前列腺癌中闡明了SALL4在蛋白表達水平作為腫瘤標志物的臨床重要性。結合我們的研究結果和相關文獻，我們認為SALL4對于前列腺癌的研究具有重要意義，SALL4蛋白可能成為未來前列腺癌診斷和預后評估的重要標記物。它在前列腺癌進展中的作用可以通過它在前列腺癌中過度表達并且與Gleason評分、臨床分期、預后及組織中PSA這幾個代表著惡性程度的指標密切相關被證明。SALL4蛋白可能將成為診斷前列腺癌新的腫瘤標志物，并可能具有評估前列腺癌患者病情、指導臨床治療方案及判斷預后的作用。但在前列腺癌發生發展的過程中，SALL4的具體生物學作用和調控機制還有待進一步研究。