Mas基因沉默對血管緊張素-(1-7)拮抗血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠腎間質成纖維細胞活化的影響*

范珊珊， 賀紅焰， 夏紀毅， 陳 楓， 張奉蓮， 劉 建△

(瀘州醫學院附屬醫院1腎病內科，2病理教研室，3分子與免疫研究室，四川瀘州646000)

腎素－血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)與腎臟纖維化密切相關。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為RAS的主要生物活性肽，主要通過作用于AngⅡ1型受體(AngⅡ type 1 receptor，AT1受體)促進多種致纖維化細胞因子及炎癥因子的合成分泌，引起細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)生成增多、積聚，參與腎臟纖維化的發生發展［1］。血管緊張素-(1-7)［angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)］是近年來研究較多的RAS新成員，具有拮抗AngⅡ、擴血管、調節水鈉、抗氧化及抗增殖等作用［2］。我們的前期研究亦證實Ang-(1-7)能夠拮抗AngⅡ誘導的大鼠腎間質成纖維細胞活化，減少ECM的合成［3］。近年來，大多數學者認為Ang-(1-7)與G蛋白偶聯受體Mas結合發揮主要作用，已有體外研究發現Ang-(1-7)可抑制AngⅡ誘導的大鼠近曲小管細胞的增殖及細胞外基質的分泌，而該作用可被Mas受體拮抗劑D-Ala(7)-Ang-1-7所阻斷［4］。但亦有研究顯示Ang-(1-7)可能存在其它非Mas受體［5］。目前，對于Ang-(1-7)是否通過與Mas受體結合發揮拮抗AngⅡ誘導腎間質成纖維細胞活化的作用尚無相關報道。本研究將體外培養大鼠腎間質成纖維細胞，觀察Mas表達抑制后對Ang-(1-7)拮抗AngⅡ誘導腎間質成纖維細胞活化的影響，了解Mas受體在其中的作用，為臨床治療腎臟纖維化提供進一步的理論依據。

材料和方法

1 材料

大鼠腎間質成纖維細胞株NRK-49F由四川大學華西醫學院惠贈;RNA提取試劑盒(北京天根);RTPCR試劑盒(大連寶生物);HiPerFect Transfection Reagent(Qiagen);Mas抗體(Santa Cruz);Ⅰ型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)檢測 ELISA 試劑盒(R＆D);Ang-(1-7)、AngⅡ和抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Sigma);免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋);siRNA由上海吉瑪公司設計合成。Mas siRNA序列 1正義鏈 5’-CC UGACCAGAGCUUUCAAATT-3’， 反 義 鏈 5’-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3’;序列 2 正義鏈 5’-GACCAAUCAAAUAUGACAUTT-3’，反義鏈 5’-AUGUCAUAUUUGAUUGGUCTT-3’;序列 3 正義鏈 5’-GCCAUUACUACACAAUCGUTT-3’，反義鏈 5’-ACG AUUGUGUAGUAAUGGCTT-3’;陰性序列正義鏈 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反 義 鏈 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2 方法

2．1 細胞培養 復蘇NRK-49F，采用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。取對數生長期的NRK-49F細胞稀釋成1×108/L細胞懸液用于實驗。

2．2 有效Mas siRNA的篩選

2．2．1 細胞轉染 將細胞接種至6孔板上，實驗分組:(1)Mas siRNA-1組:加入含Mas siRNA序列1的轉染液;(2)Mas siRNA-2組:加入含siRNA序列2的轉染液;(3)Mas siRNA-3組:加入含siRNA序列3的轉染液;(4)陰性對照組:加入含siRNA陰性序列的轉染液;(5)正常對照組:只加入轉染試劑;轉染步驟參照HiPerFect Transfection Reagent說明書進行，并對siRNA和轉染試劑用量進行優化，每孔加入siRNA 1×10－5mol/L和HiPerFect Transfection Reagent 12μL，每組設3個復孔，轉染后48 h檢測轉染效率。

2．2．2 RT-PCR 檢測 Mas mRNA 用 Trizol試劑提取細胞總RNA，以GAPDH作內參照，參照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。Mas上游引物5’-GTGGTGAAGATACGGAAGA-3’，下游引物 5’-GCTGCTATTGATGGTGGA-3’，擴增片段長度為 192 bp;GAPDH上游引物 5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’，下游引物 5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，擴增片段長度為141 bp。將逆轉錄產物進行PCR，擴增條件:94℃預變性5 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環，72℃ 5 min。電泳后，以Mas和內參照電泳條帶的吸光度比值作為各組Mas mRNA表達的比較。

2．2．3 Western blotting檢測Mas蛋白 加入細胞裂解液裂解細胞，置冰上10 min后4℃ 15 000 r/min離心5 min，收集上清液，即為提取的蛋白。經12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后電轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h。加入化學發光劑顯影曝光后，采用 Quantity One 4．4．0軟件測灰度值，分析結果。

2．3 有效Mas siRNA對Ang-(1-7)拮抗AngⅡ的影響

2．3．1 實驗分組 按不同的干預因素分6組:(1)正常對照組:僅加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基;(2)AngⅡ組:培養基中加入AngⅡ;(3)Ang-(1-7)組:培養基中加入Ang-(1-7);(4)Ang-(1-7)+AngⅡ組:同時加入 AngⅡ和 Ang-(1-7);(5)陰性siRNA對照組［Ang II+Ang-(1-7)+negative siRNA］:陰性siRNA轉染48 h后加入AngⅡ和Ang-(1-7);(6)Mas siRNA轉染組［Ang II+Ang-(1-7)+Mas siRNA-2］:Mas siRNA序列2轉染48 h后加入 AngⅡ和Ang-(1-7)。上述各組中AngⅡ終濃度均為1×10－6mol/L，Ang-(1-7)的終濃度均為1 ×10－5mol/L。

2．3．2 細胞免疫化學法檢測α-SMA 將上述分組加入藥物干預72 h后，取出6孔板中細胞爬片，4%多聚甲醛固定10 min，0．1%Triton X-100處理30 min，之后操作按免疫組織化學染色試劑盒說明書要求進行，DAB顯色后封片，倒置顯微鏡下觀察陽性信號，照相。

2．3．3 ELISA法檢測ColⅠ 將上述分組加入藥物干預72 h后，收集細胞上清液，每組設6個復孔，操作按ColⅠ-ELISA試劑盒說明書，于波長450 nm的全光譜分光光度計上讀取吸光度，取均數。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 11．5軟件進行統計學分析，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 RT-PCR結果

轉染后48 h，RT-PCR結果顯示，陰性對照組與正常對照組Mas mRNA表達無明顯差異(P＞0.05);各轉染組與正常對照組和陰性對照組相比，Mas mRNA表達均下降，其中以Mas siRNA-2組下降最明顯(P ＜0.05)，見圖1。

2 Western blotting結果

轉染后48 h，Western blotting結果顯示，陰性對照組與正常對照組Mas蛋白表達無明顯差異(P＞0.05);各轉染組與正常對照組和陰性對照組相比，Mas蛋白表達均下降，其中以Mas siRNA-2組下降最明顯(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 1．Expression of Mas mRNA in NRK-49F cells measured by RT-PCR．M:DNA marker．1:Mas siRNA-1;2:Mas siRNA-2;3:Mas siRNA-3;4:negative siRNA;5:normal control．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0.05 vs other groups．圖1 RT-PCR 檢測細胞Mas mRNA的表達

Figure 2．Expression of Mas protein in NRK-49F cells measured by Western blotting．1:Mas siRNA-1;2:Mas siRNA-2;3:Mas siRNA-3;4:negative siRNA;5:normal control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs other groups．圖2 Western blotting檢測細胞Mas蛋白的表達

3 細胞免疫化學結果

干預72 h后，AngⅡ組α-SMA表達增加，而AngⅡ+Ang-(1-7)組與AngⅡ組比較α-SMA表達下降(P＜0.05)，Ang-(1-7)組與正常對照組僅有少量α-SMA表達。Mas siRNA轉染組較AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性 siRNA對照組 α-SMA表達增加(P＜0.05)，見圖 3。

Figure 3．Expression ofα-SMA in NRK-49F cells measured by immunocytochemistry(×400)．1:normal control;2:AngⅡ;3:Ang-(1-7);4:AngⅡ +Ang-(1-7);5:Ang II+Ang-(1-7)+negative siRNA;6:Ang II+Ang-(1-7)+Mas siRNA．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs 1;△P ＜0.05 vs4 or 5．圖3 免疫組化法測各組細胞α-SMA的表達

4 ELISA結果

干預72 h后，上清液中ColⅠ水平在AngⅡ組增加，而AngⅡ+Ang-(1-7)組與AngⅡ組比較ColⅠ水平下降(P＜0.05)，siRNA轉染組ColⅠ含量較AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性siRNA對照組增加(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4．The content of ColⅠ in the culture supernatant．1:normal control;2:AngⅡ;3:Ang-(1-7);4:AngⅡ +Ang-(1-7);5:Ang II+Ang-(1-7)+negative siRNA;6:Ang II+Ang-(1-7)+Mas siRNA．Mean ±SD．n=6．*P ＜0.05 vs1;△P ＜0.05 vs 4 or 5．圖4 細胞上清液中ColⅠ的含量

討 論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病進展致腎衰竭的主要病理改變和共同通路，而腎間質成纖維細胞被激活轉化成肌成纖維細胞，過多的分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原及纖連蛋白，導致細胞外基質生成增多并沉積于腎間質是腎間質纖維化的主要特征之一［6-7］。

AngⅡ是一種主要作用于AT1受體的促生長及促纖維化因子。而Ang-(1-7)是RAS中能夠拮抗AngⅡ作用的生物活性肽［8-10］。我們前期實驗通過體外培養大鼠腎間質成纖維細胞，已經證實Ang-(1-7)可通過下調轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、胰島素樣生長因子 I(insulinlike growth factor I，IGF-I)的表達，抑制 AngⅡ引起的腎間質成纖維細胞活化，使α-SMA表達下降，細胞外基質成分ColⅠ的合成減少［3］。但是對于Ang-(1-7)是否通過與Mas受體結合發揮拮抗AngⅡ的上述作用尚待進一步研究。故本實驗采用RNA干擾技術，靶向抑制Mas基因表達后，觀察Ang-(1-7)拮抗AngⅡ作用的改變。

RNA干擾技術是利用長度約為21個堿基的雙鏈RNA，根據堿基配對原則特異性地降解同源mRNA，抑制相應基因的表達，是一種沉默靶基因的新興實驗方法［11-12］。RNA干擾技術具有快速性，高效性，特異性等優點，目前主要應用于基因功能的研究、臨床診斷及基因治療［13］。因此，實驗中我們針對Mas基因序列設計合成3對不同位點的siRNA，采用相對細胞毒性小且轉染效率高的轉染試劑HiPerFect Transfection Reagent進行細胞轉染，發現Mas siRNA序列2對Mas的抑制率達52%。由此可見，該組序列的Mas siRNA能有效抑制Mas表達。

在腎素-血管緊張素系統中，Mas受體是由Mas原癌基因編碼的，含有7個疏水跨膜結構域的G蛋白偶聯的受體。已發現Mas受體在腎臟、心臟、下丘腦、胰腺和睪丸等器官中均有表達。目前，已有大量研究表明Ang-(1-7)通過與Mas受體結合產生作用，Botelho等［14］分別給Mas基因敲除的小鼠及正常小鼠輸注Ang-(1-7)后，發現與正常小鼠相比，Mas基因缺失小鼠心搏量，腎、肺、脾臟血流量均明顯減少，說明Ang-(1-7)可通過與Mas受體結合調節全身及局部的血流量。Sampaio等［15］也證實 Ang-(1-7)通過作用于Mas受體激活內皮型一氧化氮合酶，調節血管內皮功能。另外，在大鼠心臟實驗中發現Ang-(1-7)通過激活Mas受體呈劑量依賴性地抑制AngⅡ介導的ERK1/2磷酸化，從而改善心功能［16］。同樣，動物離體實驗中亦發現，在Mas基因缺失的小鼠，Ang-(1-7)對其主動脈的血管舒張作用消失［17］。然而，有研究發現Ang-(1-7)亦可作用于AT1、AT2等非 Mas受體，De Souza等［18］證實 Ang-(1-7)呈劑量依賴性抑制大鼠近端小管Na+/K+-ATP酶活性，AT2受體拮抗劑可消除此作用，故認為Ang-(1-7)通過與AT2受體結合而發揮水鈉調節的作用。我們采用siRNA靶向抑制Mas基因的表達，發現當Mas表達下降后，Ang-(1-7)對AngⅡ的拮抗作用明顯下降，細胞α-SMA的表達和上清液中ColⅠ的分泌明顯升高，與Su等［4］研究結果相似。因此，我們認為Ang-(1-7)主要通過與Mas受體結合，發揮其拮抗AngⅡ對腎間質成纖維細胞的激活作用。

綜上所述，Mas受體在Ang-(1-7)拮抗AngⅡ、減緩腎間質纖維化中占有重要的地位，同時也為臨床防治腎臟纖維化提供了一條新的途徑。