IL-1β通過加重脂質誘導的內質網應激導致人系膜細胞損傷*

施 靜， 崔晶晶， 陽海平△， 劉 瑋， 萬俊麗， 王志鐵， 邱桂霞， 李 秋△

(重慶醫科大學附屬兒童醫院 1腎臟免疫科，2兒科研究所免疫室，重慶400014)

高脂血癥是兒童原發性腎病綜合征(primary ne- phrotic syndrome，PNS)重要的病理生理改變之一，脂質代謝紊亂或持續的高脂血癥是腎臟損害的獨立危險因素［1］，可致腎小球硬化。本課題組前期研究結果證實炎癥可加重脂質介導腎臟損害，在腎小球硬化過程中起重要作用［2］。內質網是細胞加工蛋白質和貯存Ca2+的主要場所，對各種理化因素如葡萄糖及氨基酸缺乏、缺血/缺氧、衣霉素等極為敏感，可引起內質網蛋白質加工、運輸障礙及攝取、釋放Ca2+障礙而致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。持續或過強的ERS可致細胞凋亡［3］及炎癥反應［4］。研究表明高糖、高半胱氨酸等可誘導人腎小球系膜細胞(human mesangial cells，HMCs)發生ERS，從而促進其增殖、系膜外基質產生增多;但目前高脂是否可通過啟動ERS致HMCs損害尚不清楚。本研究旨在探討炎癥能否加重高脂負荷下HMCs ERS及其具體的分子機制，為臨床防治腎臟損害提供新的分子靶點。

材料和方法

1 主要試劑

RPMI-1640培養基購于 Gibco，優等胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于天津TBD，白細胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、兔抗人核轉錄因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)購于SAB，人低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)本實驗室自備，4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)及油紅O(oil red O)購于Sigma，ELISA試劑盒購于Ray Biotech。

2 方法

2．1 細胞來源 HMCs由英國倫敦大學學院皇家自由醫學院(University College London Medical School，Royal Free Campus)阮雄中教授惠贈。

2．2 細胞培養 使用含有10%FBS的RPMI-1640培養基，在37℃、5%CO2培養箱靜置培養 HMCs。24 h換液1次，48 h可傳代。

2．3 實驗分組 待HMCs生長至對數生長期后，將細胞分為4組:(1)對照組:RPMI-1640+10%FBS;(2)高脂組(LDL):RPMI-1640+10%FBS+200 mg/L LDL;(3)IL-1β+高脂組(IL-1β+LDL):RPMI-1640+10%FBS+20μg/L IL-1β+200 mg/L LDL;(4)4-PBA干預組(4-PBA+IL-1β+LDL):RPMI-1640+10%FBS+5 mmol/L 4-PBA+20 μg/L IL-1β +200 mg/L LDL。繼續培養48 h后進行各項實驗分析。

2．4 油紅O染色觀察HMCs胞內脂質沉積情況HMCs以2×104cells/well的密度接種于24孔板內，實驗干預后棄培養基，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定30 min，ddH2O沖洗 2次，1，2-丙二醇孵育 2 min。室溫下油紅O工作液染色30 min，ddH2O洗3次，蘇木素復染1～2 min，自來水沖洗5 min，風干，中性樹膠封片。

2．5 免疫細胞化學方法檢測葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)的表達 HMCs以2×104cells/well的密度接種于24孔板內，實驗干預后棄上清，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，1%Triton X-100，3%H2O2滅活，抗原修復，血清封閉，GRP78Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗孵育。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復染，風干，中性樹膠封片。

2．6 實時定量 PCR(real-time PCR)檢測GRP78、蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和 α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)mRNA 水平將處于對數生長期的HMCs按5×105cells/well的密度接種于6孔板內，每組設3復孔。經實驗干預后收集細胞，按說明書提取細胞總RNA，RNA的A260/A280比值均為1．7～2．2。各組取等量RNA為模版逆轉錄合成cDNA。取1μL cDNA進行實時定量PCR，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參照。擴增條件:95℃ 3 min，之后95℃ 10 s，61．4℃ 30 s，共40個循環。完成后用Gene Expression Analysis for iCycler iQ Real-Time PCR Detection System 1．10軟件(Bio-Rad)計算各樣本目的基因的相對表達量。PCR引物由Invitrogen合成，序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1．Primer sequences for real-time PCR

2．7 Western blotting檢測胞核 NF-κB p65 蛋白的表達 將細胞接種于T25培養瓶中，經實驗干預后收集細胞。按試劑盒說明書提取胞漿和胞核蛋白，BCA法進行蛋白定量并標化，每孔胞核蛋白上樣量為40μg，β-actin作為內參照。樣品加變性緩沖液煮沸5～10 min。SDS-PAGE垂直凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入Ⅰ抗 NF-κB(1∶2 000)和 β-actin(1∶1 000)進行雜交，4℃孵育過夜;TBST洗膜10 min×3次，Ⅱ抗(1∶5 000)雜交，室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次。ECL光化學法進行顯影。

2．8 ELISA法檢測培養上清白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的含量 操作按試劑盒說明書進行，以吸光度(absorbance，A)值表示上清中待測蛋白含量。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，采用SPSS 18．0軟件進行數據處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 油紅O染色檢測HMCs脂質沉積

油紅O染色及半定量分析結果顯示，正常組HMCs中僅可見少量紅染顆粒，LDL組及 IL-1β+LDL組與其相比，紅染顆粒明顯增多(P＜0.05)，其中IL-1β+LDL組脂質沉積較LDL組顯著增加(P＜0.05);經4-PBA干預后HMCs胞內脂質沉積較IL-1β+LDL組顯著減少(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1．Lipid accumulation in HMCs of different groups(oil red O staining，×400)．A:control group;B:LDL(200 mg/L)group;C:IL-1β (20 μg/L)+LDL(200 mg/L)group;D:4-PBA(5 mmol/L)+IL-1β (20μg/L)+LDL(200 mg/L)group．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs A;#P ＜0．05 vs C．圖1 各組HMCs油紅O染色結果

2 不同干預對HMCs ERS信號通路GRP78-PERK軸的影響

如圖2、3所示，正常組GRP78 mRNA及蛋白、PERK mRNA表達均處于較低的水平，予以LDL及IL-1β+LDL刺激后，可顯著增加其表達(均 P＜0.05)，其中 IL-1β+LDL組GRP78 mRNA及蛋白、PERK mRNA水平顯著高于LDL組(均P＜0.05);經4-PBA干預后，其表達較IL-1β+LDL組顯著降低(均 P＜0.05)。

Figure 2．Expression of GRP78 and PERK mRNA in HMCs of different groups．Mean± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IL-1β +LDL group．圖2 各組HMCs GRP78與PERK mRNA的表達

Figure 3．Immunocytochemistry results of GRP78 protein expression in HMCs of different groups(DAB staining，×400)．A:control group;B:LDL(200 mg/L)group;C:IL-1β (20 μg/L)+LDL(200 mg/L)group;D:4-PBA(5 mmol/L)+IL-1β (20μg/L)+LDL(200 mg/L)group．Mean± SD．n=3．*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs C．圖3 各組HMCs GRP78蛋白的表達

3 Real-time PCR檢測不同干預對HMCsα-SMA mRNA水平的影響

如圖4所示，正常組存在低水平α-SMA mRNA表達，LDL刺激可增加其表達，IL-1β+LDL刺激后其表達水平顯著高于正常組及LDL組(均P＜0.05);4-PBA干預可顯著抑制 IL-1β+LDL誘導 α-SMA mRNA表達(P＜0.05)。

Figure 4．Expression ofα-SMA mRNA in HMCs of different groups determined by real-time PCR．Mean±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IL-1β +LDL group．圖4 各組HMCsα-SMA mRNA的表達

4 不同干預對HMCs核蛋白NF-κB p65及分泌IL-6、TGF-β1水平的影響

如圖5及表2所示，正常組NF-κB p65蛋白表達量、IL-6分泌量處于較低水平，予以LDL及IL-1β+LDL刺激后，NF-κB p65蛋白及IL-6水平均較正常組顯著上調(均P＜0.05)，其中 IL-1β+LDL組較LDL組明顯增多(均P＜0.05)，予以4-PBA干預可以明顯抑制 NF-κB p65及 IL-6的表達(均 P＜0.05);而各組HMCs分泌TGF-β1差異無統計學意義(均P＞0.05)。

Figure 5．Expression of NF-κB p65 protein in HMCs of different groups determined by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IL-1β+LDL group．圖5 各組HMCs NF-κB p65蛋白的表達

表2 各組細胞培養上清中IL-6和TGF-β1含量的比較Table 2．The levels of IL-6 and TGF-β1 in HMCs culture supernatants detected by ELISA(ng/L．Mean±SD．n=3)

5 HMCs脂質沉積與內質網應激相關基因及炎癥狀態的相關性分析

HMCs胞內脂質沉積與GRP78蛋白水平、PERK mRNA、NF-κB p65和 IL-6水平呈正相關(分別為:r=0.818，P ＜0.01;r=0.486，P ＜0.05;r=0.858，P＜0.01;r=0.582，P ＜0.05);GRP78 mRNA 與PERK mRNA、NF-κB p65 和 IL-6 水平呈正相關(分別為:r=0.660，P ＜0.01;r=0.784，P ＜0.01;r=0.825，P ＜0.01);NF-κB p65與 IL-6水平呈正相關(r=0.743，P＜0.01);而HMCs胞內脂質沉積和NF-κB p65水平與α-SMA mRNA水平無顯著相關性(分別為:r=0.021，P ＞0.05;r=0.137，P ＞0.05)。

討 論

1982年Moorhead等［1］首次提出“脂質腎毒性”學說以來，越來越多的研究表明脂質代謝紊亂或持續高脂血癥是腎損害的獨立危險因素，可致慢性腎臟病或腎小球硬化。在局灶節段性腎小球硬化病人腎臟組織、高脂血癥動物模型中，均能見到大量脂質在腎臟沉積或泡沫細胞形成。本課題組既往研究已證實高脂可促進HMCs分泌炎癥因子，加重炎癥反應，最終致腎小球硬化［5］。但高脂致腎臟損傷或腎小球硬化的機制尚不清楚。

近來研究表明內質網應激－未折疊蛋白反應(endoplasmic reticulum stress-unfolded protein response，ERS-UPR)在膜性腎病、膜增生性腎小球腎炎的發生發展中起重要作用［6-7］;且 ERS-UPR是脂質代謝紊亂致動脈粥樣硬化、炎癥發生、凋亡的關鍵信號通路［8］。目前對腎臟脂質代謝紊亂與 ERS-UPR關系的研究較少。GRP78是ERS的主要分子伴侶及標志蛋白，在調控ERS-UPR信號通路活化過程中發揮重要作用。在Ruan等［9］的研究中證實，炎癥因子IL-1β能明顯促進HMCs脂質的吸收，促進胞內膽固醇的合成，并減少其外流［10］，從而造成脂質在細胞內的異常積聚。本研究顯示，HMCs予以LDL刺激，胞內脂質含量增多，GRP78、PERK表達上調;進一步給予IL-1β刺激，其胞內脂質沉積、GRP78及PERK水平較單獨LDL刺激顯著增多，且胞內脂質水平與ERS狀態呈正相關。提示脂質在HMCs的異常沉積，可啟動ERS-UPR，從而激活下游 PERK信號通路，導致細胞損傷;而炎癥可加重該效應。

ERS-UPR啟動后可激發內質網與高爾基體、細胞核之間的信號轉導。NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內的重要轉錄因子，可促進炎癥反應、應激、細胞增殖與凋亡等。ERS啟動下游不同的信號通路介導NF-κB的激活可能與不同刺激劑、不同細胞種類及種屬相關［4］，存在組織器官的特異性。如:毒胡蘿卜素在人胚腎細胞中通過需肌醇酶1和腫瘤壞死因子受體相關因子2激活NF-κB［11］，小鼠胚胎成纖維細胞中，磷酸化的eIF2α對激活NF-κB轉錄活性必不可少［12］。目前，高脂能否通過ERS-UPR信號通路活化NF-κB p65致HMCs損傷的相關研究甚少。本研究發現高脂聯合炎癥狀態下，HMCs PERK、NF-κB p65及IL-6水平均較單純高脂狀態下顯著增高;且脂質沉積與 GRP78-PERK軸、NF-κB p65及 IL-6水平呈正相關。因此，我們推測本實驗中HMCs NF-κB p65水平增加可能與ERS下游GRP78-PERK信號通路活化相關，進而增加炎癥因子(如IL-6)的分泌，形成惡性循環，擴大腎臟局部炎癥反應。

α-SMA是HMCs表型轉化的重要分子標記［13］。在高糖誘導HMCs ERS模型中，其表達顯著上調［14］。在系膜增殖性腎炎中，HMCs的增殖、細胞外基質的積聚與α-SMA的表達，三者呈平行變化并具有高度相關性。我們發現在高脂誘導的HMCs ERS模型中，α-SMA mRNA水平明顯上調，通過干預ERS，可使其表達下調。提示ERS在高脂介導的HMCs表型改變中發揮重要作用。

4-PBA是人工合成小分子化合物，在穩定內質網蛋白質構象、改善內質網折疊能力、運輸突變蛋白等方面發揮作用，能有效緩解ERS的發生，是ERS的一種常用阻斷劑。本實驗經4-PBA干預后發現，4-PBA可通過降低分子伴侶GRP78及PERK的表達以達到緩解ERS發生的強度，從而降低其介導的炎癥反應、抑制HMCs表型轉化等細胞損害。同時在本實驗中還意外的發現，4-PBA亦能顯著降低HMCs胞內脂質沉積水平，但其具體分子機制尚不清楚。其是否在調控HMCs內質網膜上脂質代謝相關蛋白及轉運膽固醇合成蛋白等方面發揮作用，還有待進一步的研究。這一發現有可能為干預脂質代謝紊亂介導的一系列病理生理改變提供新的治療靶點及干預手段。