新型融合多肽HTPP-MDC體外抑制HBV復制活性及亞細胞定位*

盧雪梅， 黃演婷， 汪 潔， 金小寶， 朱家勇△

(1廣東藥學院藥用生物活性物質研究所，廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006;2南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院，廣東廣州510515)

穿膜肽是一類能夠穿透細胞膜進入細胞質甚至細胞核而不損壞細胞膜結構的小分子多肽，它的長度一般不超過30個氨基酸。近幾年的研究證實，穿膜肽能運載一系列具有不同生物學活性的物質進入活細胞內，包括蛋白、多肽、核酸和寡聚核苷酸等［1］，為分子靶向診斷和治療提供了新的思路。肝細胞靶向穿膜肽(hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide，HTPP)來源于惡性瘧原蟲環子孢子蛋白，研究發現其不但可特異性結合肝細胞表面的受體從而靶向肝臟［2］，同時還能夠有效穿透肝細胞膜，快速進入肝細胞內部［3-4］，有望成為新型雙功能小分子穿膜肽。我們課題組以HTPP為靶向穿膜部位，家蠅天蠶素(Musca domestica cecropin，MDC)作為抗病毒作用部位，將二者在分子水平進行了融合，構建了新型肝靶向穿膜融合多肽 HTPP-MDC［5-6］。HTPP-MDC有望成為高效結合、定位準確和靶向殺傷的新型生物導彈藥物，對降低乙型肝炎病毒感染引起的肝臟疾病的發病率和死亡率具有深遠意義。

我們在前期研究中利用基因重組技術將HTPP與MDC進行了融合［5］，并通過大腸桿菌表達系統成功表達了 HTPP-MDC［6］，本文主要在研究 HTPPMDC對乙型肝炎體外模型HepG2．2．15細胞株和人正常肝細胞Chang liver細胞株毒性作用的基礎上，探討HTPP-MDC對HepG2．2．15細胞乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒 e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)分泌和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV DNA)復制的影響及其在肝細胞中的定位，初步驗證 HTPP-MDC抗 HBV作用，為 HTPPMDC的臨床應用提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

1．1 主要儀器 熒光定量PCR儀和酶標儀，Bio-Rad產品;二氧化碳培養箱，Thermo Forma產品;高速冷凍離心機，Eppendorf產品;倒置相差顯微鏡，Leica產品;激光共聚焦顯微鏡，Olympus產品。

1．2 細胞株與主要試劑 HepG2．2．15細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心;胎牛血清和DMEM培養基購自HyClone;G418購自Beyotime;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma;HBsAg ELISA試劑盒和HBeAg ELISA試劑盒購自上海科華生物技術有限公司;HBV DNA熒光定量檢測試劑盒購自中山大學達安基因有限公司;蛋白異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記試劑盒購自上海生工;HTPP-MDC為本實驗室原核表達產物。其它化學試劑為進口或國產分析純。

2 方法

2．1 細胞的復蘇與傳代 細胞培養于高糖DMEM培養基中(含10% 胎牛血清，pH 7．2)，于200 mg/L G418培養基定期篩選。培養條件為95% ～98% 相對濕度、5%CO2、37℃。2～3 d換液1次，細胞生長到70% ～80%時消化(含EDTA的 0．25%胰蛋白酶)傳代。實驗前細胞密度調整為1×109/L，臺盼藍檢測活力大于85%。

2．2 HTPP-MDC對細胞株的毒性作用檢測 將對數生長期的乙型肝炎體外模型HepG2．2．15細胞和人正常肝細胞株Chang liver細胞各按1×108/L接種96孔細胞培養板，每孔200μL，37℃培養過夜，棄上清后加入200μL含不同濃度HTPP-MDC培養基(終濃度為 3．125、6．25、12．5、25、50 μmol/L)，同時設不加藥物的對照組，每個濃度設4個平行孔。每24 h換相應濃度新鮮培養基，72 h后每孔加100μL MTT溶液(5 g/L)，繼續培養4 h后每孔加入100μL DMSO溶液，振蕩溶解后，570 nm處比色測定。按下式計算藥物作用下的細胞存活率:

細胞存活率(%)=藥物處理孔A值 ÷對照孔A值×100%。

2．3 HTPP-MDC干預實驗 將對數期 HepG2．2．15細胞按每孔1×105個接種于24孔細胞培養板中，37℃培養過夜后換含藥新鮮培養基(2% 胎牛血清)，其中 HTPP-MDC 終濃度分別為1．25、2．5、5 μmol/L，以4 mg/L拉米夫定(lamivudine，LMV)為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，不含藥物孔為空白對照，每個濃度設4個平行孔。實驗設計為時間依從性，加藥后每3 d收集上清液1次，再加入新的含藥培養基，共孵育9 d。收集的第3天、第6天和第9天上清液于－20℃保存，用于HBsAg、HBeAg與 HBV DNA檢測。

2．4 HBsAg和HBeAg檢測 采用ELISA試劑盒按試劑說明書檢測HBsAg和HBeAg，按下式計算HTPP-MDC對HepG2．2．15細胞分泌 HBsAg和 HBeAg的抑制率:

抑制率(%)=(空白對照孔 A值－實驗孔A值)/空白對照孔A值×100%。

2．5 HBV DNA測定 HBV DNA定量標準品由達安基因公司直接提供，按HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書提取樣品DNA，取樣本2μL為模板，并同時設立陰性對照、臨界陽性對照和強陽性對照，各反應管放入熒光定量PCR儀，按以下條件進行擴增:93℃預變性2 min;93℃ 45 s，55℃ 1 min，10個循環;93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個循環。然后計算樣本HBV DNA拷貝數。

2．6 激光共聚焦技術研究HTPP-MDC在細胞中的定位 采用蛋白FITC標記試劑盒標記重組蛋白，具體操作為:將重組蛋白凍干粉用PBS溶解并與FITC(激發波長為490 nm，發射波長為525 nm)混合，室溫避光作用5 h，過凝膠柱純化，去掉未結合的FITC。制備HepG2．2．15細胞爬片，加入FITC標記的HTPP-MDC，室溫作用10 min，用PBS洗滌4次，封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察HTPP-MDC的細胞定位情況。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 11．5統計軟件進行分析，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 HTPP-MDC對細胞的毒性作用

不同濃度HTPP-MDC處理HepG2．2．15細胞和Chang liver細胞的存活率見表1。HTPP-MDC在3.125～50μmol/L濃度范圍內，對正常肝細胞活力無影響。HTPP-MDC的濃度≤6.25μmol/L時，HepG2．2．15細胞存活率＞95%，為藥物作用濃度的安全范圍。

表1 HTPP-MDC 對 HepG2．2．15和Chang liver細胞活力的影響Table 1．Effects of HTPP-MDCon the viability of HepG2．2．15 cells and Chang liver cells(Mean±SD．n=4)

2 HTPP-MDC 對 HepG2．2．15細胞分泌 HBsAg和HBeAg的影響

HTPP-MDC 對 HepG2．2．15細胞分泌 HBsAg和HBeAg抑制作用見圖1、2。當HTPP-MDC作用3 d后，不同濃度的 HTPP-MDC對 HepG2．2．15分泌HBsAg和HBeAg均具有顯著抑制作用(P＜0．01)。在相同濃度下，HTPP-MDC隨其作用時間的延長，抑制率亦增加;同一時點，隨著HTPP-MDC濃度的增加，抑制率隨之增加。HTPP-MDC的作用表現出顯著的量效與時效關系。

Figure 1．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBsAg secretion in HepG2.2.15 cells．LMV:lamivudine;HTPP-MDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide -Musca domestica cecropin．Mean ± SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖1 HTPP-MDC對Hep G2．2．15細胞分泌HBsAg的抑制作用

Figure 2．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBeAg secretion in HepG2.2.15 cells．LMV:lamivudine;HTPP-MDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide-Musca domestica cecropin．Mean ± SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖2 HTPP-MDC對HepG2．2．15細胞分泌HBeAg的抑制作用

3 HTPP-MDC 對 Hep G2．2．15 細胞 HBV DNA 復制的影響

HTPP-MDC對 HepG2．2．15細胞 HBV DNA 復制的抑制作用見圖3。熒光定量PCR檢測各濃度HTPP-MDC 對 HepG2．2．15 細胞作用 3、6 和 9 d后上清液中HBV DNA的拷貝數，結果顯示當HTPPMDC作用3 d后，HTPP-MDC對HepG2.2．15細胞分泌到上清中的HBV DNA均有顯著抑制作用(P＜0.01)，并且抑制程度依賴于藥物的處理濃度。

4 激光共聚焦技術研究HTPP-MDC在細胞中的定位

將重組 HTPP-MDC進行 FITC標記，與HepG2．2．15細胞孵育10 min后，激光共聚焦顯微鏡觀察可見細胞內充滿綠色熒光，提示HTPP-MDC已經透過細胞膜進入HepG2．2．15細胞內部，見圖4。

討 論

HepG2．2．15細胞是將完整雙拷貝的乙型肝炎病毒基因轉染到人肝癌細胞株 HepG2細胞中，經G418篩選得到的肝胚瘤細胞系［7］。該細胞能穩定分泌HBsAg、HBeAg及 Dane顆粒，并可在細胞內檢測到cccDNA，是目前體外研究乙肝病毒的復制規律和篩選抗乙肝病毒藥物的理想細胞模型［8］。本實驗以體外培養 HepG2．2．15細胞為研究對象，研究HTPP-MDC體外抗 HBV活性。結果證實HTPP-MDC在一定濃度范圍內對HepG2．2．15細胞沒有毒性作用，并且顯著抑制 HepG2．2．15細胞 HBsAg、HBeAg的分泌和HBV DNA復制，具有明顯的量效與時效關系。這說明我們課題組設計的HTPP-MDC具有明確的體外抗HBV活性。

Figure 3．Inhibitory effect of HTPP-MDC on HBV DNA replication in HepG2．2．15 cells．LMV:lamivudine;HTPPMDC:hepatocyte-targeting and cell-penetrating peptide-Musca domestica cecropin．Mean±SD．n=4．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖3 HTPP-MDC對 HepG2．2．15細胞 HBV DNA 復制的抑制作用

Figure 4．Evaluation of cell penetrating activity of HTPP-MDCin HepG2．2．15 cells by confocal microscope detection．圖4 激光共聚焦觀察HTPP-MDC在細胞中的定位

近年抗菌肽的抗病毒研究逐漸成為熱點，抗菌肽的抗病毒機制涉及抑制病毒DNA復制，阻斷病毒黏附侵入，以及刺激機體免疫反應等［9-11］。天蠶素類抗菌肽是其中研究歷史最長，也是研究最多的一類抗菌肽，具有殺菌、抗病毒、抗癌和免疫調節等多種功能。MDC是本實驗室從家蠅中克隆的一種昆蟲抗菌肽(GenBank登錄號為EF175878)，我們課題組前期研究顯示其不僅對多種細菌的標準菌株［12］和臨床耐藥菌［13］均具有顯著的抗菌活性，還能抑制肝癌細胞的增殖，促進機體的免疫調節功能，但對人正常肝細胞和紅細胞無毒［14］。更有意義的是 MDC對HepG2．2．15細胞的HBsAg表達具有抑制作用，并呈現一定的濃度依賴關系。這些研究提示MDC對肝臟疾病的臨床治療具有良好的應用前景。因此本課題組提出將MDC與HTPP進行融合的設想。本研究證實設計的HTPP-MDC具有明確的體外抗HBV活性，同時激光共聚焦觀察也證實HTPP-MDC能夠有效穿透肝細胞膜，快速進入肝細胞內部，表明之前的設計是成功的。目前抗菌肽抗病毒機制研究相關報道不多，根據有限的文獻［9-11］我們對HTPP-MDC抑制HBV復制的機制進行大膽推測，認為其可能涉及直接破壞病毒包膜、與病毒糖蛋白相互作用及免疫調節作用等，當然具體的抗病毒機制還有待于進一步的實驗驗證。

穿膜肽作為藥物運輸工具，目前研究所發現的大多數缺乏細胞特異性且定位不精確，限制了它的進一步發展［15］。近年研究發現的 HTPP，來源于惡性瘧原蟲環子孢子蛋白，在其序列中不僅含有1個PELEX/VTS(Plasmodium export element/vacuolar transport signal)基序，能夠有效穿透肝細胞膜，介導環子孢子蛋白進入肝細胞內部，實現細胞亞定位［3-4］，同時還具有肝素結合域，能夠特異性靶向肝臟［2］，因此HTPP將成為備受青睞的肝細胞靶向穿膜肽。

HTPP-MDC作為小分子多肽類藥物，具有作用明確、毒性低、同時兼有靶向肝細胞內抗HBV和免疫調節多重作用，在開發新型抗HBV藥物中具有廣闊的開發利用價值及市場應用前景，但HTPP-MDC的體內外抗病毒作用及其作用機制還需進行深入研究。