高效硝化細菌的篩選及特性研究

王小菊 何春平 王 震 邢傳宏 宋安東 陳紅歌 * (.河南農業大學生命科學學院河南 鄭州 45000；.鄭州大學水環學院河南 鄭州 45000)

硝化細菌是一類廣泛存在于自然界,在生物脫氮過程中起到重要作用的微生物[1-2],通過硝化作用把氨氮轉化為亞硝酸鹽,再進一步把亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽.其硝化速率直接影響污水處理系統的硝化效果和脫氮效率.有研究表明,污水中硝化細菌的濃度與硝化速率成正比[3],因此,要用于處理污水,必須篩選出生長速率高、硝化作用強的硝化細菌.大多數硝化細菌生長緩慢,最適溫度在25～30℃[4-5],高于亞硝化細菌的最適溫度(20～25℃),因而由亞硝酸鹽轉化到硝酸鹽的時間就較長,特別是在冬季氣溫低時,硝化反應成為整個反應的限速步驟.因此,篩選并馴化得到性能優良的硝化細菌種群并進一步提高它們在污水處理系統中的數量是提高生物脫氮效率的重要途徑[6-8].

本試驗擬從蓮花味精廠SBR污水處理反應池中篩選出高效硝化細菌,并對其進行低溫馴化,以獲得耐低溫的硝化細菌菌株,進一步研究其硝化特性以及在活性污泥絮體中的地位,從而為有效利用該菌株提高低溫下SBR廢水處理效率奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 含菌樣品

采自河南蓮花味精集團有限公司污水處理廠序批式反應池(SBR)中污水.

1.2 培養基

液 體 培 養 基 :NaNO21.0g,MgSO4·7H2O0.5g,Na2CO31.0 g,FeSO4·7H2O0.4g,加蒸餾水定容至lL.該培養液在滅菌前用 NaOH調pH值為 7.5～8.0,再加 0.5g K2HPO4(磷酸鹽單獨滅菌,并且在培養液冷卻至室溫后加入).

平板分離培養基: 成分同液體培養基,另加入1.0%的瓊脂糖.

1.3 硝化細菌的篩選及硝化速率的測定

1.3.1 菌種篩選 取5mL從曝氣池中取回的污水接種至含 100mL硝化細菌液體培養基的250mL三角瓶中,30℃、170r/min振蕩富集培養10d,每隔2d在白瓷板上分別滴加2～3滴二苯胺試劑[9],檢查培養物中NO2-的減少和NO3

-的形成.選取顏色變化深的培養液按稀釋分離的方法將培養液稀釋至 10-3、10-4、10-5三個稀釋度,分別在硝化細菌固體培養基上涂布分離,30℃恒溫培養箱中培養 10d左右,挑取典型單菌落分別移植于20mL液體培養基的100mL三角瓶中,30℃、170r/min振蕩培養 10d,同樣依前述方法檢驗硝化細菌富集培養液中培養物中 NO2-的減少和的形成.分離培養試驗重復兩次,將最后獲得的純培養物移斜面固體培養基上保藏.

1.3.2 硝化菌液的制備 將上述單菌株分別接種到含20mL液體培養基的100mL三角瓶中進行搖床培養,每個菌株接一個搖瓶,設不接菌的裝有同樣液體培養基的三角瓶作為 NO2-測定的對照.28℃、170r/min振蕩培養15d后,將培養液于5000r/min離心15min,取上清液進行硝化速率測定.

1.3.3 硝化速率的測定 硝化速率以單位時間、單位體積培養液轉化NO2-的量(即的減少量)表示,硝化速率的單位為mg/(L·d).采用比色法[10]和離子色譜法[11-12]測定NO2-的量.

比色法:光密度-亞硝酸鹽濃度標準曲線為y=0.6612x-0.0013(R2=0.9997),根據標準曲線計算硝化菌液中亞硝酸鹽的濃度,硝化速率按下式計算:

式中:C1為不接種樣品中亞硝酸根濃度,mg/L;C0為接種樣品中亞硝酸根濃度,mg/L;t為培養時間,d.

離子色譜法:采用 Dionex ICS3000型離子色譜儀,色譜分離柱為IonpacAS19陰離子交換柱,配 AG19保護柱,用 Dionex電導檢測器 ,配Dionex ASRS300 4mm 抑制器.

將待測樣品適當稀釋后用0.22μm濾膜過濾,然后將濾液放進色譜進樣器中,進樣體積為25μL,流速為 1.0mL/min,流動相用 20nmol/LNaOH溶液,線性范圍在 0～2.0μg/mL,檢出限為 0.4μg/mL.

1.4 硝化細菌的鑒定

菌株的形態鑒定參照文獻[13]進行.參照《微生物實驗技術》[14]對分離出的菌株進行革蘭氏染色試驗和相應的生理生化試驗,包括乙酰甲基甲醇試驗,甲基紅試驗,吲哚試驗,檸檬酸鹽利用試驗,16S rDNA菌種鑒定試驗.

1.5 硝化細菌的耐低溫馴化

用接種環挑取篩選到的硝化速率最高的單菌株接入 20mL硝化細菌液體培養基,15℃下靜置培養,每隔 3d用比色法檢測培養液中的含量并計算硝化速率.當培養液中的NO2-全部轉化為NO3-時,取馴化的菌液2mL轉接入新鮮配制的20mL硝化細菌液體培養基,進行第2次馴化,同樣檢測亞硝酸鹽的轉化情況,當培養液中的NO2-全部轉化為NO3-時,再進行第3次、第4次馴化,直至硝化細菌在15℃下轉化穩定.將最后1次轉接的菌種保存在平板或試管斜面.

1.6 硝化條件的優化

1.6.1 最適轉化溫度 為了保證接種培養物的均一,將2種溫度下(30,15℃)保存的菌先在30℃下培養5d,然后取培養菌液2mL分別接入20mL新鮮的硝化細菌液體培養基,在不同的溫度下(10,15,20,25,30,35℃)培養,5d后比色法檢測NO2-→NO3-的轉化情況,并計算硝化速率[mg/(L·d)].

1.6.2 在最適轉化溫度下不同 pH 值 將在15℃下馴化保存的菌的擴大培養液 2mL分別轉接入20mL不同初始pH值(pH5,6,7,8,9)的新鮮液體培養基,分別在最適轉化溫度下培養 5d檢測菌液 NO2-→NO3-的轉化情況,并計算硝化速率.

1.6.3 在最適轉化溫度下添加不同濃度葡萄糖 將在 15℃下馴化保存的菌的擴大培養液2mL分別轉接入2mL含不同初始濃度(0,1,2,3,4g/L)的葡萄糖(在原有培養基的基礎上添加)的新鮮液體培養基,分別在最適轉化溫度下培養5d檢測菌液的NO2-→NO3-的轉化情況,并計算硝化速率.

1.6.4 在最適轉化溫度下添加不同初始濃度NaNO2將在 15℃下馴化保存的菌的擴大培養液 2mL分別轉接入 20mL含不同初始濃度(0.5,1,2,3,4g/L)的 NaNO2的液體培養基,分別在最適轉化溫度下培養5d檢測菌液的的轉化情況,并計算硝化速率.

1.7 硝化細菌單菌在活性污泥絮體中的地位

分別提取污泥絮體和硝化細菌單菌株的總DNA,用作 16S rDNA V3區擴增的模板,各對其V3區進行擴增.上游引物:F341-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’),其 中GC發夾是為滿足變性梯度凝膠電泳(DGGE)的溫度而加.下游引物:R-518(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’).反應條件:94℃預變性 3min;94℃變性30S,56℃退火30S,72℃延伸45S,28個循環;最后 94℃變性 30S,56℃退火 30S,72℃延伸7min,4℃保存.擴增結束后,各取5μL擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測.電泳條件:電壓120V,電泳45min.最后對16S rDNA的V3區擴增產物做DGGE分析.

2 結果與分析

2.1 高效硝化細菌的篩選

取SBR反應池中污水接種至硝化細菌液體培養基中,振蕩富集培養,經二苯胺初篩后,取顏色變化深的培養液做平板分離,挑取生長快、菌落大的10株單菌接入液體培養基中,進行硝化速率的測定,結果如表1所示.可以看出,大多數經富集再分離所得的菌株都顯示了硝化活力.將硝化速率最高的N4菌株的硝化液進行離子色譜法驗證,結果如圖 1.可知 N4菌株幾乎將培養液里的全部氧化為 NO3-,說明 N4具有很強的硝化能力.從表1和圖1可以看出,用比色法和離子色譜2種方法檢測表現出一致的結果.對N4連續進行3次搖瓶硝化試驗,證實其有穩定的硝化速率,硝化速率為(52.0±3.5)mg/(L·d).

表1 不同菌株的硝化速率[mg/(L·d)]Table 1 Nitrification rate of different strains[mg/(L·d)]

2.2 N4菌株的鑒定

N4菌落特征:菌落中央為圓形,菌落乳白色,不透明,邊緣整齊.

N4菌株有關生理生化鑒定試驗結果見表2.

提取N4菌株的總DNA進行16S rDNA擴增(圖2).測序顯示,該序列長度為1449bp,相似性比對表明該菌株16S rDNA序列同已發表的索氏菌屬(Thauera)和固氮弧菌屬(Azoarcus)的 16S rDNA同源性最高,但均低于97%而大于96%.提取索氏菌屬和固氮弧菌屬的模式種[15],與 N4菌株進行系統發育分析,如圖3所示.可知N4同固氮弧菌屬的模式種聚在一起,初步認為N4菌株屬于固氮弧菌屬(Azoarcus).

圖1 離子色譜測定結果Fig.1 Analysis of NO2- and NO3- by ion chromatography

表2 N4菌株生理生化鑒定試驗Table 2 Physiological and biochemical tests of N4

圖2 16S rDNA的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA

圖3 依據16S rDNA序列構建的菌株N4和相關菌種系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of N4 and related bacterial species constructed according to 16S rDNA sequence

2.3 N4的耐低溫馴化

將N4單菌落接入液體培養基中,15℃下進行第1次馴化.每隔3d用比色法檢測培養液中NO2-的含量并計算硝化速率,培養至第 15d時培養液中的 NO2-全部轉化為NO3-,取馴化的菌液2mL轉接入同樣的新鮮液體培養基,進行第2次馴化.同樣方法檢測至第8d時培養液中的NO2-全部轉化為NO3-.第3次馴化至7d時培養液中的NO2-全部轉化為NO3-.第4次馴化至8d時培養液中的NO2-全部轉化為NO3-.4次馴化所得的硝化速率結果如表3所示.可以看出N4在15℃下經過4次馴化后,硝化速率非常穩定.將第4次馴化的菌液做斜面保存,保存的菌種命名為N4-L.

表3 N4的低溫馴化Table 3 Low temperature acclimation of N4

2.4 N4-L的硝化特性

2.4.1 N4-L最適硝化溫度 將低溫馴化得到的菌株N4-L及出發菌株N4的種子培養物分別接入硝化細菌液體培養基中,在不同溫度下培養,結果如圖4所示.N4-L和N4在15℃以上溫度培養時都保持相對較高的硝化速率,在15,20,25℃下N4-L表現出略高于N4的硝化速率,但N4-L的最適轉化溫度同N4一樣,都在20～30℃之間.為研究N4-L在低溫下的硝化特性,以下試驗均在15℃下進行.

綜上所述，軟交換與IMS技術之間存在一定的聯系，加強對軟交換和IMS技術研究和應用能夠為下一代交換組網建設提供相應的支持。因此電信運營工作中要加強對軟交換和IMS技術的重視，并進行系統的探究，爭取逐步形成全新的認識，有效促進下一代交換組網的建設和發展。

圖4 溫度對硝化速率的影響Fig.4 The effect of temperature on the nitrification rate

2.4.2 pH值對硝化速率的影響 將N4-L的種子培養物分別接入不同初始pH值的液體培養基中,在 15℃下培養,結果如圖 5所示.初始 pH值在6.0～8.5范圍內N4-L在 2種溫度下均具有較高的硝化速率,且當pH值為8.0時硝化速率最高.

圖5 pH值對硝化速率的影響Fig.5 The effect of pH on the nitrification rate

2.4.3 葡萄糖濃度對硝化速率的影響 將 N4-L的種子培養物分別接入不同初始葡萄糖濃度的液體培養基中,在 15℃下培養,結果如圖 6所示.葡萄糖濃度在2g/L時, N4-L的硝化速率達到最高,當葡萄糖濃度繼續增加硝化速率反而降低.說明有機質的存在不影響該菌的硝化能力,此時細菌以混合營養型生長,即同時利用有機質和亞硝酸鹽的氧化獲得能量而生長,但當有機質量過高時會影響到無機底物的氧化.

圖6 葡萄糖濃度對硝化速率的影響Fig.6 The effect of glucose concentration on the nitrification rate

2.4.4 NaNO2濃度對硝化速率的影響 取 N4-L的種子培養物分別接入不同初始NaNO2濃度的液體培養基中,15℃培養,結果如圖7所示.NaNO2濃度在1g/L時,N4-L的硝化速率最高,隨著NaNO2濃度的增加,硝化速率相應降低.

圖7 亞硝酸鈉濃度對硝化速率的影響Fig.7 The effect of sodium nitrite concentration on the nitrification rate

2.5 N4-L在活性污泥絮體中的地位

分別提取N4-L菌株和冬季SBR活性污泥絮體的總DNA(圖8),以16S rDNA的V3區引物進行PCR擴增,得到約230bp的DNA片段(圖9),對其進行DGGE分析,結果如圖10所示.可以看出,N4-L的特征性條帶在活性污泥絮體DGGE中的對應條帶很弱,不是主條帶,可以說明篩選出的低溫N4-L菌株在蓮花味精廠廢水SBR污泥絮體中不占優勢地位.

圖8 總DNA的提取Fig.8 The extraction of total DNA

圖9 16S rDNA的V3區擴增Fig.9 The amplification of V3 region of 16S rDNA

圖10 16S rDNA V3區的DGGE檢測Fig.10 The DGGE detection of V3 region of 16S rDNA

3 討論

通過對N4菌株的16S rDNA序列分析,結合其形態及生理生化特征,表明該菌為固氮弧菌屬,又因其與固氮弧菌屬已知菌株同源性低于 97%,表明該菌株極有可能是固氮弧菌屬中的一個潛在新種,具有兼性自養的硝化細菌的特征,能夠在無機營養和混合營養條件下進行亞硝酸鹽的氧化.此特征與Zare等[16]報道的一株新的硝化細菌Nitrobacteria hamadaniensis相類似,該菌株在混合營養下的生長和硝化高于無機營養下的情況.

對N4菌株進行低溫馴化后其硝化能力明顯提高,硝化速率最高達到120.7mg/(L·d)以上,高于目前已報道的硝化細菌的硝化能力[35.89～70mg/(L·d)][17-19],具有較好的實際應用價值.

4 結論

4.1 從SBR反應池中篩選得到一株硝化速率最高的菌株N4,對其進行耐低溫馴化得到N4-L,硝化速率最高達到120.7mg/(L·d)以上.

4.2 N4-L菌株為兼性自養硝化細菌,對有機質具有較好的耐受性,在 pH 為 8.0、葡萄糖濃度為2g/L、NaNO2濃度為1g/L時該菌株具有最強的硝化能力.

4.3 N4-L不是污泥絮體中的優勢菌,采取措施使N4-L菌株成為絮體優勢菌可能是提高SBR脫氮運行效率的有效途徑.

[1]徐 建,張德純,周 廣.微生物在城市污水處理系統中的應用與展望 [J]. 中國微生態學雜志, 2006,18(1):75-77.

[2]有馬啟,田村學造.生物凈化環境技術 [M]. 郭麗華,等譯.北京:化學工業出版社, 1990:180-181.

[3]Lin Y, Kong H N, He Y L, et a1. Simultaneous nitrification and denitrification in a membrane bioreactor and isolation of heterotrophic nitrifying bacteria [J]. Japanese Journal of Water Treatment Biology, 2004,40(3):105-114.

[4]王歆鵬,陳 堅,華兆哲,等.硝化菌群在不同條件下的增殖速率和硝化活性 [J]. 應用與環境生物學報, 1999,5:64-68.

[5]崔袁園.低溫硝化細菌的篩選及應用研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業大學, 2006.

[6]章非娟.生物脫氮技術 [M]. 北京:中國環境科學出版社, 1992:55-67.

[7]金志剛,屈計寧,何群彪.硝化細菌富集技術分析及方法研究 [J].上海環境科學, 1998,17(8):16-19.

[8]Shan H, Obbaed J P. Ammonia removal from freshwater using nitrifying bacteria enriched from a seawater aquaculture pond [J].Biotechonlogy, 2003,25(17):1469-1471.

[9]胡朝松,李春強.海洋沉積物中反硝化細菌的分離鑒定及反硝化性能研究 [J]. 環境科學研究, 2009,22(1):114-118.

[10]國家環境保護總局水和廢水監測分析方法 [M]. 4版.北京:中國環境科學出版社, 2002:230-351.

[11]王 莉.離子色譜的原理及應用 [J]. 天津科技, 2006,(3):48-49.

[12]劉耀華,倪劉健.離子色譜法測定綠茶與烏龍茶中的F-,Cl-,NO3-,[J]. 環境科技, 2009,22(1):32-33.

[13]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊 [M]. 北京:科學出版社, 2001.

[14]姚占芳,吳云漢.微生物學實驗技術 [M]. 北京:氣象出版社.1989.

[15]Song B, Palleroni N J, Kerkhof L J, et a1. Characterization of halobenzoate-degrading, denitrifying Azoarcus and Thauera isolates and description of Thauera chlorobenzoica sp. Nov [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001,51:589–602.

[16]Zare M, Heidari M H, Pouresmaeili F, et al. Introducing a novel facultative nitrifying bacterium, "Nitrobacteria hamadaniensis".African Journal of Microbiology research, 2012,6(24):5126-5133.

[17]Magalhaes C M, Joye S B, Moreira R M, et a1. Effect of salinity and inorganic nitrogen concentrations on nitrification and denitrification rates in intertidal sediments and rocky biofilms of the Douro River estuary [J]. Portugal Water Research, 2005,39(9):1783-1794.

[18]余敦耀,邱雁臨,朱 影.高效硝化細菌的分離與鑒定 [J]. 化學與生物工程, 2008,25(4):60-63.

[19]Loh K, Chung T, Ang W. Immobilized-cell membrane bioreactor for high-strength phenol wastewater [J]. Journal of Environmental Engineering, 2000,126(1):75-79.

致謝：本實驗的現場采樣工作由河南蓮花味精集團有限公司污水處理廠的工作人員協助完成,在此表示感謝.