全反式維甲酸對人肝癌SMMC-7721細胞侵襲能力的影響

李海燕，曹勵民，王秉亮

（1.西安交通大學醫學院醫學技術系，西安 710021；2.中鐵一局集團中心醫院普外科，西安 710021）

肝癌為世界第六大惡性腫瘤，影響肝癌預后的主要因素就是復發和轉移。臨床資料顯示，約60%以上的肝癌（含早期肝癌）確診時已發生臨床或顯微鏡下轉移［1］。因此，抗肝癌治療的關鍵在于抗侵襲轉移。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）已廣泛用于白血病的治療，新近研究發現［1～3］，它還可抑制乳腺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤的侵襲和轉移，但其作用機制還不明確。人肝癌細胞株SMMC-7721是來源于人低分化肝細胞癌的細胞系，與正常肝細胞比較，增殖速度快，具有較強的惡性行為（如遷移能力和侵襲能力）。因此我們探討ATRA對人肝癌細胞株SMMC-7721遷移侵襲能力的影響，為ATRA應用于臨床的肝癌治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人肝癌細胞株SMMC-7721（中國科學院上海細胞生物研究所），以PRMI1640培養基+10%小牛血清常規培養。

1.1.2 實驗試劑與配制：ATRA購自Sigma公司，以二甲基亞礬（DMSO）配制。小牛血清RPMI1640培養基（Gibco公司），Matrigel膠（美國BD公司），Transwell侵襲小室 （Coming公司），fluorophore Sybr Green（Netherlands 公司），Total RNA Kit（Omega 公司）。BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司），CD147、MMP-2、α-tublin一抗（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 劃痕試驗：把1×106個SMMC-7721細胞種植于6孔板，至細胞融合狀態（90%），血清培養基饑餓24 h；用10 μL移液器槍頭在培養板底部做“十”字劃痕，劃痕時要用直尺定位。加新鮮無血清培養基，加入 ATRA，調節濃度分別為10、20、40 μmol·L-1。37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，倒置顯微鏡觀察并拍照，使用Image J軟件測量并統計劃痕區寬度。未處理組（對照組）與實驗組均設3個平行樣本。

1.2.2 Transwell小室試驗：無血清培養基與Matrigel膠以9∶1配制，放Transwell小室于24孔板內，將稀釋好的Matrigel膠50 μL置于Transwell上層。37℃過夜，待Matrigel膠凝固后，每孔加無血清培養基300 μL，每個孔種植細胞1×105個，加入ATRA，調節藥物濃度為10、20、40 μmol·L-1，置于細胞培養箱孵育。24 h后分別取出小室，分別以PBS清洗3次，棉簽刮除濾膜上的細胞，膜下面細胞用甲醛固定，1%結晶紫染色15 min，PBS洗3次。倒置顯微鏡下高倍鏡觀察并拍照，Image J軟件計數細胞數值，結果以細胞數表示。

1.2.3 Real-time PCR：以10，20，40 μmol·L-1ATRA處理細胞，在24 h以Total RNA Kit提取細胞總RNA，逆轉錄合成 cDNA。GAPDH、CD147、MMP-2基因引物及內參GAPDH基因引物設計及反應參數參考文獻［4，5］，引物經上海生物工程有限公司合成。CD147，F：5′-ACTCCTCACCTGCTCCTTGA，R：5′-GCC TCCATGTTCAGGTTCTC-3′；MMP-2，F：5′-GGCAGTG CAATACCTGAACACC-3′，R：5′-GTCTGGGGCAGTCC AAAGAACT-3′；GAPDH，F：5′-GCACCGTCAAGGCTG AGAAC-3′，R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。用儀器 CFD3120 MiniOpticon Detector（美國BIO-RAD公司）進行實時定量PCR，按儀器使用說明書進行設置及操作。結果應用GraphPad Prism5.0軟件進行數據分析，相對表達量采用2-△△Ct方法計算［6］。

1.2.4 Western blot：以10、20、40 μmol·L-1ATRA 處理細胞，在24 h收集細胞，以RIPA細胞裂解液（加1∶100 PMSF）裂解細胞，提取細胞總蛋白。蛋白質定量變性后上樣，SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，標準轉膜75 min。將轉有蛋白條帶的膜常規封閉、洗膜后分別與特異性一抗4℃孵育過夜，PBST洗4次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，PBST洗4次，每次5 min，化學發光劑檢測蛋白質印跡，薄層掃描儀測定印跡區帶的光密度值。觀察各條帶深淺變化并加以分析，α-tublin作為對照。實驗重復3次。結果在凝膠成像儀上照相并使用BIO-RAD公司Quantity One分析軟件測量條帶灰度值，目的條帶與α-tublin條帶灰度值比值即為該目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ATRA對人肝癌SMMC-7721細胞遷移能力的影響

劃痕試驗結果顯示，對照組的SMMC-7721在24 h，細胞距離比0 h減少（P<0.05），這個實驗結果說明SMMC-7721細胞的遷移能力較強。各劑量ATRA實驗組與對照組細胞在0 h劃痕距離比較一致，但以ATRA處理24 h后，較對照組劃痕距離增加（P<0.05），實驗結果表明ATRA可呈劑量依賴性抑制SMMC-7721細胞的遷移能力（圖1）。

2.2 ATRA對人肝癌SMMC-7721細胞侵襲能力的影響

Transwell試驗結果顯示，10，20，40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細胞24 h后，穿膜細胞數分別為55.3±0.52、42.8±0.21、31.1±0.34，與對照組（73.6±0.45）比較，明顯減少（P<0.05），該結果表明 ATRA可呈劑量依賴性降低SMMC-7721細胞侵襲能力（圖2）。

2.3 ATRA對SMMC-7721細胞CD147表達的影響

Real-time PCR 結果顯示，以10、20、40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細胞24 h后，CD147mRNA表達水平明顯下調，與對照組比較差異具有統計學意義 （P<0.01）；Western blot結果顯示，10、20、40 μmol·L-1ATRA處理 SMMC-7721細胞24 h后，CD147蛋白表達下調（P<0.05），呈劑量依賴性（圖3、圖 4）。

2.4 ATRA對SMMC-7721細胞MMP-2表達的影響

Real-time PCR 結果顯示，以10、20、40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細胞24 h后，MMP-2mRNA的表達水平下調，與對照組比較差異具有統計學意義（P<0.05）；Western blot結果顯示，以10、20、40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細胞24 h后，與對照組比較MMP-2蛋白表達下調（P<0.05）。實驗結果表明ATRA可呈劑量依賴性明顯下調MMP-2（圖5、圖 6）。

3 討論

惡性腫瘤患者死亡的主要原因是侵襲和轉移。因此抑制腫瘤的侵襲轉移就成為了治療腫瘤的突破點，尋找抑制腫瘤轉移的藥物更是研發的熱點［7～9］。在腫瘤發展過程中，抑制腫瘤細胞的黏附、侵襲和遷移都有可能降低腫瘤的轉移能力［10～15］。

ATRA作為誘導分化劑在急性早幼粒細胞白血病中的應用取得了令人鼓舞的成效，近年來，很多研究者已從細胞學、動物實驗以及臨床試驗的角度對胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤用ATRA進行誘導、分化治療。初步的結果發現，ATRA對惡性腫瘤細胞具有誘導分化、抑制增殖、誘導凋亡等作用，同時在抑制實體腫瘤的侵襲轉移中也逐漸顯示作用［16］。

劃痕愈合實驗、Transwell小室細胞侵襲實驗是目前常用的體外研究腫瘤細胞遷移、侵襲行為的經典方法。在劃痕愈合實驗中我們發現，對照組具有很強的遷移能力，劃痕后24 h，劃痕處大部分愈合。而在實驗組，ATRA作用于SMMC-7721細胞后，其遷移能力卻非常弱，對比劃痕0 h的圖片結果，經過24 h的培養劃痕處未見愈合。這與陳宏輝等［17］研究結果一致；Transwell小室細胞侵襲實驗中，我們的研究表明，隨著ATRA作用于SMMC-7721細胞時間的延長，與對照組比較，SMMC-7721細胞的穿膜數明顯降低，這提示ATRA可呈劑量依賴性抑制SMMC-7721細胞的侵襲能力，這與汪思應等［18］和李冰等［19］的研究結果一致。

CD147是一種高表達于肝癌細胞的細胞表面跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，參與肝癌細胞的生長調控以及侵襲、轉移等多種過程，其表達量的高低與肝癌的復發、轉移及耐藥性形成等惡性行為存在明顯的正相關關系，是一種影響治療效果和預后的重要標志性分子。我們的研究結果顯示，ATRA無論從mRNA水平還是蛋白水平均呈劑量依賴性下調CD147的表達。

細胞外基質金屬蛋白酶 （extracellular matrix metalloproteinase，MMPs），是一個鋅離子依賴的蛋白酶家族，目前已發現26個成員。MMPs的主要功能是降解細胞外基質，腫瘤細胞利用MMPs的基質降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質交界處，MMPs往往呈高表達。研究證實，CD147能夠誘導腫瘤細胞本身表達MMPs，尤其是MMP-2增加明顯。我們的研究結果顯示，ATRA無論從mRNA水平還是蛋白水平均呈劑量依賴性下調MMP-2表達。

本研究初步證明了ATRA能夠抑制人肝癌SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力，該作用可能與下調CD147引發的MMP-2下調有關，具體分子機制尚需進一步研究。上述研究為ATRA抑制肝癌侵襲與轉移的臨床應用提供了思路。

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