化療耐藥及敏感卵巢癌細胞差異表達microRNA的篩查與組織鑒定

陶陶，王敏

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽110004）

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，發病率在女性生殖系統惡性腫瘤中占第二位［1］，死亡率仍徘佪在70%左右，高居婦科惡性腫瘤首位，晚期患者的5年生存率僅為25%～30%［2］。盡管近年來手術、化學藥物治療和放射治療技術不斷改進，卵巢癌5年生存率仍無明顯提高［3］。其中最重要一個原因是30%～40%的卵巢癌患者對化療耐藥；不僅如此，60%對一線化療敏感的卵巢癌患者在半年以后也產生耐藥。因此明確卵巢癌耐藥的確切機制以及耐藥逆轉已成為當前全球婦產科學界極其緊迫而重要的研究課題。microRNA是新近發現的一種發育時序性基因［4］，與婦科惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關。microRNA芯片是用來檢測microRNA表達譜的一種生物芯片，適用于大規模的基因檢測和基因功能的研究、疾病發生機制的研究及臨床診斷等方面。本研究采用microRNA表達譜基因芯片方法檢測化療耐藥及敏感卵巢癌細胞差異表達microRNA后，選取部分差異表達的microRNA進行實時聚合酶鏈反應驗證，從基因水平研究卵巢漿液性癌化療耐藥發生的相關機制，為卵巢漿液性癌的積極治療及改善預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 microRNA表達譜基因芯片與卵巢癌細胞：microRNA表達譜基因芯片為北京博奧生物有限公司提供的Affymetrix基因芯片。microRNA表達譜基因芯片檢測的細胞為紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3，均由浙江大學醫學院附屬婦產科醫院提供。

1.1.2 實時聚合酶鏈反應的臨床標本：收集2008年8月至2011年8月中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科經手術切除后病理學檢查證實為卵巢漿液性癌的新鮮組織標本共106例。所有卵巢漿液性癌患者均具備完整的病理資料，對系統行紫杉醇+卡鉑化療治療患者的化療情況跟蹤隨訪6個月，其中化療耐藥組20例，化療敏感組20例。40例卵巢漿液性癌患者年齡38～79歲，平均年齡55.25歲。絕經后患者33例，絕經前患者7例。按國際婦產科聯盟2009年手術病理分期標準：Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期29例，Ⅳ期0例；G1級1例，G2級20例，G3級19 例；分期行淋巴結清掃術26例，其中有盆腔淋巴結轉移11例。化療耐藥及敏感標準根據2010年美國國立綜合癌癥網絡卵巢癌臨床實踐指南，腫瘤在6個月內復發的患者為化療耐藥，初次化療后6個月或更長時間復發的患者被認為是“敏感”的病例［5］。

1.2 實驗方法

1.2.1 microRNA表達譜基因芯片檢測：按照總RNA的提取說明書抽提基因芯片總RNA，對基因芯片靶標制備及標記microRNA，進行芯片雜交染色及掃描并檢測與分析。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應：為鑒定表達譜基因芯片，對miR-17～92基因簇在卵巢漿液性癌組織中采用實時聚合酶鏈反應方法進行檢測。（1）提取組織的總RNA：用液氮法提取組織中的總RNA置于0.01%DEPC-H2O中，-80℃冰箱保存備用。（2）cDNA合成：按反轉錄試劑盒（PrimescriptTMRT reagent Kit）產品說明書將總RNA反轉錄成cDNA，用10 μL反應體系。（3）擴增：用TaqMan microRNA試劑盒提供的特異的實時聚合酶鏈反應引物對合成的cDNA進行實時聚合酶鏈反應。每個標本都用β-actin作為內對照，β-actin的水平同樣用TaqMan探針法進行測定。其中miR-17～92基因簇引物及探針序列：F5′-CAGTAAAGGTAAGGAGAGCTCAATCTG-3′；R5′-CA TACAACCACTAAGCTAAAGAATAATCTGA-3′；6-FA M-TGGAAATAAGATCATCATGCCCACTTGAGAC-TA MRA。β-actin 引物及探針序列：F5′-GCAAAGACCT GTACGCCAACA-3′；R5′-TGCATCCTGTCGGCAATG-3′；6-FAM-TGGCGGCACCACCATGTACC-TAMRA。經過PCR反應后得到擴增曲線。將底物用DEPC水按照10 倍梯度稀釋成1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000，進行實時聚合酶鏈反應獲得標準曲線。

1.3 統計學處理

分析實時聚合酶鏈反應中基因表達的相對變化采用改良的相對定量法（Fold induction=2ΔCt），采用SPSS17.0統計軟件包對所得結果進行兩兩樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 microRNA表達譜基因芯片結果

根據Affymetrix基因芯片技術分別檢測紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3中microRNA表達，檢測出原始芯片數據共2張，對檢測出原始芯片數據采用聚類分析軟件CLUSTER3.0分析，表達譜基因芯片可篩查出不同表達的microRNA，其中黃色代表高表達，藍色代表低表達（圖1）。

2.2 差異表達microRNA的數據分析

利用p-value方法對基因芯片雜交結果進行分析，篩選出171個相關的microRNA，其中miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307 等 69 個microRNA 高表達 （上調趨勢），miR-134、miR-34、miR-196b等102個microRNA低表達（下調趨勢）。miR-17～92基因簇是與卵巢癌耐藥最相關的microRNA之一。見表1。

2.3 實時聚合酶鏈反應對miR-17～92在卵巢漿液性癌組織中的驗證結果

由已知拷貝數的標準品繪制標準曲線（圖2），根據樣品的Ct值求出樣品的模板量，以確定應用目的基因與內參基因的擴增效率一致。應用實時聚合酶鏈反應檢測miR-17～92基因簇在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中擴增曲線（圖3），miR-17～92基因簇在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中平均Ct值分別為28.745～35.845及28.175～31.46，β-actin平均 Ct值分別為17.17～22.41及18.175～21.38。miR-17～92基因簇在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中的表達量為2.2143E3±6.97E2，在化療敏感卵巢漿液性癌組織中的表達量為1.4841E3±6.44E2，化療耐藥組中的表達量水平顯著高于化療敏感組（P<0.01），與芯片結果一致。

2.4 miR-17～92基因簇表達與卵巢漿液性癌臨床病理學特征的關系

miR-17～92基因簇表達量與卵巢漿液性癌患者絕經前后、手術病理分期、組織學分級、是否行淋巴結清掃術和有無淋巴結轉移均無明顯相關性（P值分別為0.648、0.377、0.896、0.692、0.274，均 P>0.05），對20例化療耐藥卵巢漿液性癌miR-17～92基因簇表達進一步分析亦與其臨床病理學特征無關（P值分別為0.142、0.574、0.428、0.784、0.874，均 P>0.05），見表2。

3 討論

microRNA是一種發育時序性基因，microRNA與腫瘤的關系已在多種腫瘤中得到證實。大量的研究表明，microRNA在女性生殖系統疾病，包括卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮平滑肌瘤、卵巢子宮內膜異位癥等的表達密切相關［6～8］。表達譜基因芯片技術通過對mRNA的熒光分子進行標記來檢測基因表達水平的變化，是集分子生物學、細胞遺傳學、生物化學、生物信息學等多種高新技術為一體的研究手段，它是一種對基因序列及功能進行大規模、高通量的研究方法。有關卵巢癌與正常卵巢組織或細胞的表達譜基因芯片研究已有報道，但應用表達譜基因芯片對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3進行基因表達譜分析尚未見報道。

我們通過對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3進行基因表達譜芯片分析，篩選出了171個與紫杉醇耐藥卵巢癌細胞相關的microRNA，基因表達增高（上調趨勢）69個，為miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307 等，基因表達降低（下調趨勢）102個，為miR-134、miR-34、miR-196b等，我們發現miR-17～92是與卵巢癌耐藥最相關的microRNA之一，因此認為microRNA表達譜基因芯片可篩查出化療耐藥及敏感卵巢癌細胞的差異表達基因，miR-17～92基因簇與卵巢癌化療耐藥有關。miR-17～92是一個典型的多順反子miRNA基因簇，在人類基因組中位于染色體13q31.3基因cl3或f25的內含子3上，此區域在多種類型淋巴瘤及實體瘤中被擴增［9］，與細胞增殖有關。miR-17～92基因簇大約占據人類染色體的800對堿基對，包括miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b 和miR-92-1。它參與了心、肺、免疫系統的發育、血管生長及前脂肪細胞分化等過程。miR-17～92基因簇誘導腫瘤發生主要是通過抑制抑癌基因和細胞周期調控基因的表達實現的。細胞增殖周期調節失控是惡性腫瘤的一個重要特征，miR-17～92基因簇參與腫瘤的發生也與其干擾細胞周期的調節有關。在離體條件下，轉染miR-17～92基因簇到不同的淋巴瘤細胞中能使促凋亡蛋白基因BIM和抑癌基因p21的表達下調［10］。我們前期應用病毒介導法將構建的與卵巢癌耐藥最相關的miR-17～92抑制質粒轉染入耐藥卵巢癌細胞抑制其表達，發現miR-17～92基因簇可以抑制耐藥卵巢癌細胞的增殖，使耐藥卵巢癌細胞阻滯在G2/M期。

目前有關microRNA在卵巢癌化療耐藥中的作用研究主要集中在表達譜基因芯片的建立上，對于篩查出的microRNA在卵巢癌化療耐藥中的功能角色的研究才剛剛起步。Boren等［11］及Orrentino等［12］已證明microRNA表達的不同與卵巢癌化療耐藥與敏感有關。如miR-214通過影響PTEN以及蛋白激酶B（Akt/PKB）的功能，誘導細胞存活和順鉑耐藥［13］。我們隨后選取化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織各20例進行實時聚合酶鏈反應檢測miR-17～92基因簇，比較表達譜基因芯片與實時聚合酶鏈反應表達結果是否一致。發現miR-17～92基因簇在化療耐藥卵巢漿液性癌組織表達明顯上調，化療敏感組織表達下調，與芯片結果一致。本研究首次表明，miR-17～92基因簇在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織有差異表達，與卵巢漿液性癌化療耐藥相關。Lewis等［14］研究認為，miR-17～92通過PTEN和BIM起作用，miR-17～92作用于靶蛋白后如何參與卵巢癌的耐藥及其相關耐藥通路的調控，值得進一步深入研究。因此，對microRNA進行分析可為卵巢漿液性癌化療耐藥的研究提供理論依據，可作為化療耐藥卵巢癌患者治療及預后的新靶點，為卵巢癌患者的化學藥物治療提供了新的研究方向，有可能成為新的基因治療途徑，對改善卵巢癌患者的治療現狀具有重要的現實意義。

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