叉頭框轉錄因子M1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及意義

吳文藝，張麗婷，王朝陽，邱建龍，朱世澤

（1.福建醫科大學附屬第二醫院普通外科，福建 泉州3 62000；2.解放軍第一八零醫院內分泌科，福建 泉州3 62000）

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的一種類型，占甲狀腺惡性腫瘤的80%～85%［1］。盡管大部分病例預后良好，l0年生存率超過90%～95%［2］，但文獻報道甲狀腺乳頭狀癌的發病率近幾十年呈上升趨勢［3］，且依靠現有的方法無法判定臨床頸淋巴結陰性（cN0）病例有無頸部淋巴結轉移。如其他系統的腫瘤一樣，基因改變長期以來被認為在甲狀腺腫瘤的發生中起到一個基本的作用［4］，其機制可能為抑癌基因啟動子的高甲基化［4，5］、基因突變或表達異常。叉頭框轉錄因子Ml（forkhead box M1，FoxM1）是Fox轉錄因子家族的重要成員，在肝癌、乳腺癌和腦惡性膠質細胞瘤等多種惡性腫瘤中過度表達，被認為是促進這些惡性腫瘤發生發展的重要因素，對這些腫瘤的生長、侵襲及血管形成能力均有重要影響［6～8］。本研究采用實時熒光定量PCR和Western blot，分別從mRNA和蛋白水平檢測FoxM1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，探討其在甲狀腺乳頭狀癌發生發展中的作用，以期為其早期診治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所有新鮮組織標本均于2011年2月至2012年3月取自福建醫科大學附屬第二醫院普通外科（均取得患者知情同意），其中甲狀腺乳頭狀癌組織20例、癌旁正常甲狀腺組織20例（對側甲狀腺正常組織）及甲狀腺腺瘤20例作為對照組。甲狀腺乳頭狀癌組中男8例，女12例；年齡26～62歲，中位年齡42歲；其中伴區域淋巴結轉移10例，根據國際抗癌聯盟和美國抗癌協會2002年的甲狀腺癌臨床分期，I期8例，Ⅱ期6例，Ⅲ期3例，ⅣA期3例。所有病例的癌組織經術后病理證實均為甲狀腺乳頭狀癌，術前甲狀腺功能均正常，均未接受放、化療，均有完整的臨床和病理資料。所取標本均平分切成2份（對側甲狀腺正常組織平分切成3份，其中1份送病理檢查證實為正常組織），一份置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于Western blot，另一份則置于RNA樣品保存液中，于4℃冰箱中保存，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒ReverAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis kit購自加拿大MBI公司，熒光定量PCR試劑SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本東洋紡生物技術有限公司，RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒、UltraECL底物化學發光檢測試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，兔抗人FoxM1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，紫外可見分光光度計（DU800）購自美國貝克曼庫爾特公司，基因擴增儀（PE9600）購自美國ABI公司，熒光定量PCR儀（ABI7500）購自美國ABI公司，凝膠成像分析系統（Tanon-2500）購自上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR：應用實時熒光定量PCR檢測20例甲狀腺乳頭狀癌組織及相應的20例癌旁正常甲狀腺組織和20例甲狀腺腺瘤組織中FoxM1 mRNA的表達情況。

1.3.1.1 RNA提取及逆轉錄反應 根據Trizol使用說明書，稱取標本各約50 mg抽取其RNA，分光光度計測定各樣品OD260與OD280吸光值，計算比值OD260/OD280，要求在1.80～2.00之間，同時1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。電泳顯示28S、18S和5S條帶完整清晰。逆轉錄反應：1 μg經檢測合格的總 RNA、0.5 μL Oligo（dT）、0.5 μL Random primer、2 μL10 mmol/L dNTPs mix、4 μL5 ×buffer、0.5 μL RNase inhibitor、0.5 μL M-MLV，并加水至20 μL，30℃保溫10 min；42℃保溫60 min；72℃保溫10 min終止反應，取出-20℃保存備用。

1.3.1.2 熒光實時定量PCR 按照東洋紡熒光定量PCR試劑使用說明書，混合10 μL SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，10 ummol/L上下游特異引物各0.5 μL，9 μL適當稀釋的cDNA模板，總反應體積為20 μL，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行如下反應：95℃5 min（1個循環）；95℃15 s，60℃15 s，72℃32 s采集熒光信號強度（40個循環），重復實驗3次。內參基因選用人類18srRNA基因（GenBank 號：NR_003286，Homo sapiens18S ribosomal RNA）。引物序列自行設計，上游引物：CCTGGA TACCGCAGCTAGGA，下游引物：GCGGCGCAATACG AATGCCCC，擴增產物大小為112 bp；FoxM1上游引物：TGGATCTTGGGTTCTTCACT，下游引物：ACCCA CACTCTGCTTCAGTT，擴增產物大小為200 bp。將PCR產物作熔解曲線分析，確定產物特異性。

1.3.1.3 結果分析 采用定量PCR儀自帶分析軟件分析各樣品各基因表達情況。相對定量的計算方法采用2-ΔΔCT法，具體計算公式：ΔΔCT=（CT.Target-CT.Actin）Timex-（CT.Target-CT.Actin）Time0，RQ 值 =2-ΔΔCT。 RQ T.Target與RQ T.Actin的比值即為相對定量值，其中T.Target為目的基因，T.Actin為內參基因，Timex為病理樣品，Time0為正常人樣品。

1.3.2 Western blot檢測：應用Western blot檢測20例甲狀腺乳頭狀癌組織及相應的20例癌旁正常甲狀腺組織和20例甲狀腺腺瘤組織中FoxM1蛋白的表達情況。每例標本取3 g，將組織剪切成細小的碎片（組織直徑1 mm）。按照每20 mg組織加入150 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。12000 r/min，4℃離心5 min，收集上清，用于后續實驗。采用北京百泰克生物技術有限公司生產的BCA法蛋白定量試劑盒測定各樣品總蛋白含量。SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，加入適當稀釋的一抗、二抗（一抗稀釋倍數為200倍，二抗稀釋倍數為1000倍），ECL化學發光法檢測顯影。底片通過凝膠灰度分析軟件Quantity One 4.6.2進行灰度值定量。每組實驗重復3次。

1.4 統計學處理

實驗所得數據均采用SPSS17.0軟件進行分析，采用t檢驗或ANOVA分析比較均值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FoxM1mRNA的表達情況

FoxM1mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織（41.68±15.65）中呈高表達，在癌旁正常甲狀腺組織（2.73±1.00）、甲狀腺腺瘤組織（2.32±1.06）中呈低表達。甲狀腺乳頭狀癌組織中FoxM1mRNA的表達顯著高于其對應的癌旁正常甲狀腺組織（P=0.000）和甲狀腺腺瘤組織（P=0.000）。癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織中FoxM1mRNA表達的差異無統計學差異（P=0.257）。

2.2 FoxM1蛋白的表達情況

FoxM1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織（0.897±0.117）中呈高表達，在癌旁正常甲狀腺組織（0.211±0.029）和甲狀腺腺瘤組織（0.193±0.028）中呈低表達。甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁正常甲狀腺組織及甲狀腺腺瘤組織比較，FoxM1蛋白表達的差異有統計學意義（P<0.01）。癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織中FoxM1蛋白表達的差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.3 FoxM1mRNA及蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系

在甲狀腺乳頭狀癌組織中，FoxM1mRNA及蛋白在有淋巴結轉移組的表達要高于無淋巴結轉移組，有包膜侵犯組FoxM1mRNA及蛋白表達高于包膜無侵犯組，差異均有統計學意義（均P<0.01）。FoxM1mRNA及蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期均無關（P>0.05）。見表1。

3 討論

FoxM1是Forkhead蛋白家族中的一員，定位于染色體12p13.3末端著絲粒區域，全長約25 kb，僅在具有分裂活性的細胞中表達。FoxM1與細胞增殖密切相關，Wonsey等［9］發現，FoxM1在DNA 合成前期、DNA合成期和有絲分裂期表達顯著增強，可介導細胞進入DNA合成和有絲分裂期。FoxM1對細胞增殖的影響主要是通過抑制細胞周期素依賴性激酶抑制劑p21Cip1/Waf1和p27Kip，進而影響某些細胞周期素或細胞周期素依賴性激酶活化劑Cdc25a和Cdc25b磷酸酶的活性來實現的［10］。FoxM1功能的缺失可能阻礙細胞分化，并最終導致細胞惡性轉變［11］。FoxM1基因在多種腫瘤細胞中異常高表達，促進腫瘤的發生發展及腫瘤干細胞存在和功能的發揮，如在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌、上皮性卵巢癌、腦膠質細胞瘤、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中異常升高，是促進多種惡性腫瘤細胞增殖和侵襲的關鍵轉錄因子［6～8，12～19］。

本研究中，熒光實時定量PCR結果顯示FoxM1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌的表達明顯高于癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織。Western blot結果與實時定量PCR結果一致，FoxM1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織的表達明顯高于癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織，而癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織FoxM1mRNA及蛋白表達的差異均無統計學意義（P>0.05）。有包膜侵犯組FoxM1mRNA及蛋白表達明顯高于包膜無侵犯組，差異有統計學意義（P<0.01）。甲狀腺乳頭狀癌組織中FoxM1表達異常升高，可能促進了甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展及包膜的侵襲。劉鋼等［20］的研究表明，凋亡抑制基因Survivin在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達明顯高于癌旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織，結合本研究結果，我們推論甲狀腺乳頭狀癌組織中FoxM1表達異常升高，是引起其下游基因Survivin在甲狀腺乳頭狀癌異常表達的根本原因。本研究還發現，有頸部淋巴結轉移組FoxM1mRNA及蛋白的表達較無淋巴結轉移組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01），這可能是甲狀腺乳頭狀癌易于早期出現頸部淋巴結轉移的原因之一。但它在頸部淋巴結轉移過程中所發揮的作用及作用的大小以及發生淋巴結轉移的確切機制尚不明確，需進一步證實。

影響甲狀腺乳頭狀癌預后的因素有性別、年齡、腫瘤大小、原發癌是否侵出包膜及有無周圍器官侵犯［21］。本研究顯示FoxM1mRNA及蛋白在不同性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期的甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達差異無統計學意義（P>0.05），提示甲狀腺乳頭狀癌中FoxM1的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期無關。

綜上，FoxM1的過度表達在甲狀腺乳頭狀癌的發生發展、淋巴結轉移、包膜侵犯中可能有重要作用，可能是其發生過程中的早期事件。但FoxM1 mRNA及蛋白在不同性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期的甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達無明顯差異，提示甲狀腺乳頭狀癌的發病過程中可能有多種因素參與，單一FoxM1的過度表達并不能預測甲狀腺乳頭狀癌的預后，FoxM1在甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展中的作用及確切機制還需要進一步的研究。

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