建立同時測定人血漿中拉莫三嗪和奧卡西平的HPLC法

朱雪萍，陳曉萌，秦玉花，趙寧民，馬愛玲，趙淑娟，蔡海霞（1.鄭州大學第五附屬醫院，鄭州45005；.鄭州大學河南省人民醫院，鄭州 45000）

拉莫三嗪是是一種新型的抗癲癇類藥，能穩定突觸前膜，抑制谷氨酸和天冬氨酸的釋放。奧卡西平是國際公認的較好的新型抗癲癇藥，是卡馬西平衍生物，在體內迅速代謝為活性產物單羥奧卡西平和環氧卡馬西平，副作用較小，無不良藥物相互作用。這2種藥物個體差異較大，治療窗窄，受多種藥物相互作用的影響，且毒性反應與血藥濃度密切相關。二者在臨床上常有聯用，均可借助血藥濃度監測來調整劑量[1-2]，以達到提高療效、規避不良反應的目的。本研究以氯唑沙宗為內標，用高效液相色譜（HPLC）法同時測定上述2種藥物的血藥濃度，操作簡單、回收率高、精密度好，可以同時用于檢測拉莫三嗪和奧卡西平的血藥濃度。

1 材料

1.1 儀器

680高效液相色譜儀，包括ASI-100進樣器、TCC-100柱溫箱、UVD170 U檢測器（美國戴安公司）；MM-3定時微量振蕩器、可調微量加樣槍（泰州科健醫療用品有限公司）；0412-1離心機（上海安亭科學儀器廠）；PS3120超聲波清洗器（美國Sonics公司）；FA1104電子分析天平（上海天平儀器廠，稱量范圍：0～120 g，讀數精度：0.1 mg）；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機（上海恒勤儀器設備有限公司）；NH-866渦旋混和器（萊利達國際公司）。

1.2 藥品與試劑

拉莫三嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100775-200401，純度：100%）；奧卡西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100657-200401，純度：100%）；內標：氯唑沙宗標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100364-200301，質量分數：100%，mg/ml）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma公司C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.05%三氟乙酸-水（40∶60∶0.0005，V/V/V）；檢測波長：240 nm；流速：1 ml/min；柱溫：40℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的配制

取拉莫三嗪4.4 mg、奧卡西平5.2 mg，準確稱定，分別用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，使其質量濃度分別為440 μg/ml和520 μg/ml。準確稱取內標氯唑沙宗標準品2.4 mg，加入甲醇溶解并定容至100 ml量瓶中，使其質量濃度為24 μg/ml。

2.3 血漿樣品預處理

取血漿樣品100 μl于1.5 ml離心管中，加入甲醇溶液300 μl，渦旋混合 2min，超聲提取 10min，4000r/min 離心 15 min。定量吸取上清液，40℃空氣吹干，殘留物加流動相100 μl溶解，渦旋混合1 min，12000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進樣，得含拉莫三嗪0.5～50 μg/ml、奧卡西平0.5～50 μg/ml的系列質量濃度標準血樣。

2.4 專屬性考察

在“2.1”項色譜條件下，取空白血漿按“2.3”項下方法處理后進樣分析，結果表明血漿內源性物質對樣品測定無干擾。取“2.3”項下標準血樣處理后進樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結果表明拉莫三嗪、奧卡西平與內標氯唑沙宗的保留時間分別為7.41、15.44、18.14 min，各成分峰形良好、分離完全。

2.5 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

取“2.3”項下含拉莫三嗪50、10、2、1、0.5 μg/ml和奧卡西平50、10、2、1、0.5 μg/ml的標準血樣，處理后進樣測定，記錄色譜。分別以樣品與內標的峰面積比（Y）對濃度（c）線性回歸。得拉莫三嗪、奧卡西平標準曲線方程分別為：Y＝0.5511 c－0.5669（r＝0.9940）、Y＝0.4026 c－0.5895（r＝0.9925）。結果表明，拉莫三嗪、奧卡西平血藥濃度均在0.5～50 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2”項下工作液，加入適量空白血漿，配成含拉莫三嗪分別為25、10、2 μg/ml和奧卡西平分別為25、10、2 μg/ml的低、中、高3種質量濃度血樣。各血樣按“2.3”項下方法處理后，連續測定5批，計算得3個濃度血樣中拉莫三嗪的RSD分別為4.01%、6.15%、4.64%，奧卡西平的RSD分別為3.05%、4.27%、9.01%，結果見表1。

表1 拉莫三嗪和奧卡西平精密度試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of precision tests of lamotrigine and oxcarbazepine（n＝5）

2.7 回收率試驗

精密量取不同濃度的拉莫三嗪、奧卡西平標準溶液各10 μl，置于1.5 ml離心管中，40℃空氣揮干，加入空白血漿0.5 ml，制成高、中、低3個質量濃度（5、25、50 μg/ml）的質控樣品各5份，按“2.3”項下方法操作，將測得的峰面積與未經提取的標準溶液峰面積比較，計算提取回收率，即提取回收率＝A/As×100%。式中A為血漿樣品溶液中藥物的峰面積，As為相應標準溶液中藥物的峰面積，結果見表2。

表2 拉莫三嗪和奧卡西平的提取回收率（n＝5）Tab 2 Extraction recoveries of lamotrigine and oxcarbazepine（n＝5）

2.8 穩定性試驗

2.8.1 常溫穩定性：取“2.6”項下低、中、高3種質量濃度血樣，分別于室溫放置0、2、4 h后處理測定，計算得拉莫三嗪的RSD為2.55%～8.77%，奧卡西平的RSD為3.54%～8.25%。表明血樣于室溫放置4 h穩定，結果見表3。

表3 拉莫三嗪和奧卡西平常溫穩定性試驗結果（n＝3）Tab 3 Results of stability tests of lamotrigine and oxcarbazepine under room temperature（n＝3）

2.8.2 4℃穩定性（48 h）：取上述3種濃度血樣，分別于4℃放置0、24、48 h后處理測定，計算得拉莫三嗪的RSD為3.02%～5.70%，奧卡西平的RSD為3.42%～5.59%。表明血樣于4℃放置48 h穩定，結果見表4。

表4 拉莫三嗪和奧卡西平4℃穩定性試驗結果（n＝3）Tab 4 Results of stability tests of lamotrigine and oxcarbazepine at 4℃（n＝3）

2.8.3 多次凍融試驗：取上述3種濃度血樣各3份，于－20℃冷凍保存至少24 h后室溫解凍重復3次后，處理測定。結果拉莫三嗪的RSD為1.49%～6.10%，奧卡西平各濃度的RSD為2.70%～8.22%。表明血漿樣品3次凍融后穩定性良好，結果見表5。

表5 拉莫三嗪和奧卡西平多次凍融穩定性試驗結果（n＝3）Tab 5 Results of stability tests of lamotrigine and oxcarbazepine after repeated freeze-thawing（n＝3）

3 討論

奧卡西平在257 nm波長處有最大吸收波長[3]，拉莫三嗪在225 nm波長處有最大吸收[4]。本法采用了240 nm的波長，目的是為了兼顧兩者的含量測定，減少基線的漂移和雜質峰的影響。

奧卡西平為卡馬西平的流動相為衍生物，理化性質相似，且臨床上一般不會同時應用奧卡西平與卡馬西平，因此本試驗首先嘗試用卡馬西平作為內標。但試驗證實，卡馬西平在本條件下保留時間約30 min左右，因此不適于作為內標。有文獻報道，氯唑沙宗為內標時保留時間在拉莫三嗪和奧卡西平之后[5]，經試驗驗證，保留時間約18min左右，且分離度良好，因此選用氯唑沙宗為內標。同時考慮本條件下奧卡西平與氯唑沙宗保留時間較接近，若兩者濃度均較大可能會互相影響，因此將內標溶液配置為24 μg/ml，按照樣品制備方法進樣時內標質量濃度為18 μg/ml。

經考察在流動相為40%甲醇時樣品分離度良好[6]，但若加入血漿樣品時拉莫三嗪與內源性物質產生干擾，因此嘗試在流動相中加入酸，從而改變其保留時間，同時使峰形得到優化。在流動相中加入乙酸與磷酸時均未使拉莫三嗪與內源物質達到理想分離度，因此選取0.1%三氟乙酸。此條件下化合物與內源物達到良好分離度，同時峰形較佳。但此濃度三氟乙酸會使柱壓上升，經考察將三氟乙酸濃度減半，即0.05%三氟乙酸對柱壓影響較小并可使化合物得到良好分離。

考慮到臨床檢測血藥濃度會在同一時間檢測多人的血樣，因此選取3個濃度各5個平行樣品連續測定對精密度進行考察。

臨床血藥濃度監測工作中經常需對血樣標本進行保存，以進行批量監測。因此，本研究對常溫穩定性、4℃穩定性、多次凍融穩定性進行了考察，以確定樣品的可存放時間及存放條件。

隨著HPLC在醫院的普及，采用HPLC測定血藥濃度將會日益廣泛[7]。

拉莫三嗪和奧卡西平在臨床日常應用中存在聯用現象，因此，在臨床檢測中有時候會要求同時檢測二者的血藥濃度。有些患者醫療知識欠缺，出現中毒癥狀時說不清究竟自己以往用的是哪種藥品；有些患者在某些不規范的醫療機構服用的中藥制劑中摻雜有多種不明化學成分的藥品，同時檢測多種藥物血藥濃度就顯得十分重要[8]。現在三級醫院等級評審工作中明確要求醫院開展血藥濃度監測工作，且不會僅僅限于大醫院，許多基層醫院均會開展血藥濃度監測工作。鑒于這2種藥物尚不能采用熒光偏振免疫分析（TDX）儀等專業化大型設備檢測，增加采用HPLC法的血藥濃度監測項目有很強的現實意義。

本研究采用HPLC法，可以同時測定拉莫三嗪和奧卡西平血藥濃度。本法操作簡單、回收率高、精密度好，適用于臨床上單獨檢測拉莫三嗪或奧卡西平的血藥濃度，也適于同時檢測二者血藥濃度。

[1]楊潔，焦正，施孝金.高效液相色譜法同時測定人血漿中6種抗癲癇藥物及2種活性代謝物的濃度[J].中國藥學雜志，2006，41（24）：1899.

[2]St.Louis EK.Minimizing AED adverse effects：Improving quality of life in interictal state in epilepsy care[J].Curr Neuropharmacol，2009，7（2）：106.

[3]任汝仙，彭世萍，李雅琴，等.RP-HPLC法測定人血漿中奧卡西平濃度及其藥動學研究[J].中國藥房，2010，21（38）：3596.

[4]劉海濤，唐躍年.HPLC法測定癲癇患兒血漿中拉莫三嗪的濃度[J].中國藥房，2011，22（2）：128.

[5]李佩瑾，蔣莉，劉官信.不同劑量拉莫三嗪對體外培養海馬神經細胞存活及其BDNF和P-CREB表達的影響[J].重慶醫科大學學報，2009，34（10）：1330.

[6]杜軍，李憶軍.RP-HPLC測定拉莫三嗪和苯巴比妥的血藥濃度[J].中國醫藥導報，2010，7（8）：39.

[7]和凡，溫預關，楊彤，等.LC/MS/MS法測定癲癇患兒血漿中拉莫三嗪的濃度[J].今日藥學，2011，21（3）：154.

[8]焦正，趙志剛，施孝金，等.比較HPLC和FPIA法測定人血清中卡馬西平的血藥濃度[J].中國臨床藥理學雜志，2004，20（4）：291.