PIK3CA在胃癌病變中表達的研究*

馬菲菲 張慶瑜 王 濤 康春生 徐 蓉 蔡鳳英 宋小妹

磷脂酰肌醇3－激酶催化亞基α（PIK3CA）基因位于3號染色體長臂26號位點3區，全長34 kb，編碼IA型磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的p110α催化亞基，即PI3Kp110α蛋白。目前普遍認為PIK3CA的突變在肺癌[1]、腦癌、乳腺癌、結腸癌[2]等多種實體腫瘤發生發展中具有重要作用。但有研究證實，PIK3CA基因突變在胃癌發生發展過程中的作用不明顯[3]，胃癌中PIK3CA表達是否增強，與腫瘤病理分型存在何種關系，在PI3K/Akt信號通路中起到何種作用尚不清楚[4]。本研究采用組織芯片和免疫組織化學技術，檢測和分析了不同病理級別胃腺癌、癌旁組織和正常胃黏膜中的PIK3CA及IA型PI3K/Akt通路主要成員絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（pAkt）、細胞增殖相關核抗原（ki-67）的表達及相互關系，旨在探討其在腫瘤增殖、侵襲與轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）組織芯片。組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司，包含胃腺癌及其匹配癌旁組織與正常胃黏膜組織組合微陣列，其中45例腺癌及其匹配的癌旁組織每例2點，10例正常組織每例1點。點數100，10×10排列，直徑1 mm，厚度5 μm。在45例腫瘤樣本中男33例，女12例，年齡30～78歲，中位年齡59歲，其中低分化腺癌8例，中分化腺癌28例，高分化腺癌9例；10例正常組織樣本中男9例，女1例，年齡16～50歲，中位年齡37歲。芯片的每個點樣均經過病理診斷。（2）試劑。鼠抗人PIK3CA單克隆抗體購自Abnova公司、兔抗人pAkt(1∶100)多克隆抗體、鼠抗人ki-67(1∶100)單克隆抗體購自Santa Cruz公司，山羊抗兔HRP二抗、馬抗小鼠HRP二抗、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 組織芯片脫蠟至水，消除內源性過氧化物酶活性，抗原修復、室溫孵育后，依次加1∶100稀釋的一抗，棄一抗，0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)沖洗，3 min，連續3次，加1∶100稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37℃孵育30 min，滴加1∶100稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min，連續3次。常規脫水，透明、樹脂封片，顯微鏡觀察、拍照。以上免疫染色以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組化結果判定 PIK3CA、pAkt胞漿胞核出現DAB著色為陽性表達，ki-67只有細胞核著色時視為陽性表達，用裝有目鏡網格微測尺的200倍視野計數8個網格中的PIK3CA、pAkt、ki-67蛋白表達陽性和陰性的腫瘤細胞數，按各種蛋白陽性腫瘤細胞占所有腫瘤細胞總數的百分比，將其分為4個等級：無陽性細胞為-，陽性細胞lt;30%為+，陽性細胞30%～60%為++，陽性細胞gt;60%為+++。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，各組間差異比較采用R×C列聯表資料的χ2檢驗，蛋白陽性表達的相關性采用Spearman等級相關進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胃腺癌、癌旁組織、正常胃黏膜組織中PIK3CA、pAkt、ki-67的表達 胃腺癌組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色以+++為主，呈彌漫的棕黃色或棕褐色染色，相應的癌旁組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色以++～+++為主，呈小灶或彌漫的棕黃色或棕褐色染色，正常胃黏膜組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色陽性者均為+，點狀棕黃色或棕褐色染色，見圖1～3。PIK3CA、pAkt、ki-67在胃癌及其癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達陽性率差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。3種組織中PIK3CA與pAkt、ki-67表達均呈正相關（rs分別為0.916、0.945，均Plt;0.01），ki-67、pAkt表達亦呈正相關（rs=0.890,Plt;0.01）。

Table 1 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in gastric carcinoma and adjacent tissues and normal gastric tissues表1 PIK3CA、pAkt和ki-67在胃癌及其癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達

2.2 不同病理級別胃腺癌中PIK3CA、pAkt、ki-67的表達情況 PIK3CA、pAkt、ki-67在低分化腺癌黏膜組織中染色以++～+++為主，呈彌漫的棕黃色或棕褐色染色，在中分化腺癌黏膜組織中染色以+～+++為主，呈小灶或彌漫的棕黃色或棕褐色染色，在高分化腺癌黏膜組織中染色多數為陰性，見圖1～3。PIK3CA、pAkt、ki-67在不同病理級別胃癌中表達的陽性率差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。胃腺癌組織中PIK3CA與pAkt、ki-67表達均呈正相關（rs分別為0.885、0.934，均Plt;0.01），ki-67、pAkt表達亦呈正相關（rs=0.833,Plt;0.01）。

Table 2 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in different pathological grades of gastric carcinoma表2 PIK3CA、pAkt和ki-67在不同病理級別胃癌中的表達

3 討論

3.1 胃癌組織中PIK3CA表達與腫瘤發病的關系 本研究中PIK3CA在胃癌及其癌旁組織的陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織，提示PIK3CA的過度表達在胃癌的發病中發揮了重要的作用。PIK3CA與pAkt在不同病理組織中表達的正相關，則進一步說明PIK3CA表達水平對PI3K/Akt信號通路活性存在影響，以往研究表明PIK3CA編碼PI3K的催化亞基p110α，是PI3K/Akt信號通路中重要組成部分[5]，由此推斷胃腫瘤組織中PIK3CA表達水平上調導致PI3Kp110α的催化活性增強，促使Akt磷酸化，進而激活PI3K/Akt信號傳導途徑，促進了胃腫瘤的發病。另外，ki-67是一種細胞增殖相關核抗原[6]，與細胞周期密切相關，能較好地反映腫瘤細胞的增殖活性。本研究中PIK3CA與ki-67在不同病理組織中表達的正相關，提示PIK3CA表達水平上調可能間接地促進了胃癌腫瘤細胞的增殖。

3.2 胃癌組織中PIK3CA表達與腫瘤分化程度的關系 本研究顯示不同病理級別的胃腺癌組織中PIK3CA表達的差異具有統計學意義，說明PIK3CA高表達與胃癌細胞分化程度存在關聯，越來越多的研究證明，PI3K/Akt信號通路中pAkt在調節細胞進程過程中起了重要作用，如細胞生長和增殖、細胞凋亡、細胞運動和侵襲，其機制可能為Akt的持續性表達能誘導上皮間質轉變，賦予了組織侵襲和轉移所需的運動性[7]。本研究中PIK3CA與pAkt的表達在不同病理分級的胃腫瘤組織中呈正相關，且PIK3CA、pAkt蛋白的表達陽性程度隨胃腺癌的惡性程度的增高而增高，由此推測PIK3CA在胃腫瘤的增殖與分化中發揮了重要作用，其表達上調使其下游靶向分子Akt過度激活，進而產生一系列生物學行為。除此之外，本研究中，ki-67的表達也與PIK3CA、pAkt者之間存在正相關關系，說明在胃癌的發病中PIK3CA與腫瘤的增殖密切相關，其機制可能是PIK3CA作為PI3K/Akt信號通路的始動因子，促使Akt磷酸化，進而激活PI3K/Akt信號傳導途徑，促進胃癌增殖、侵襲與轉移。聯合檢測這3個指標的表達程度，將進一步提高胃腫瘤的早期診斷率，估計患者預后，指導治療。

Figure 1 Expressions of PIK3CA in different gastric tissues（Envision method×200）圖1 PIK3CA在不同組織中的表達（Envision法×200）

Figure 3 Expressions of ki-67 in different gastric tissues（Envision method×200）圖3 ki-67在不同組織中的表達（Envision法×200）

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[2]Zhu YF,Yu BH,Li DL,et al.PI3K expression and PIK3CA mutations are related to colorectal cancer metastases[J].World J Gastroenterol?ogy,2012,18(28):3745-3751.

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