貓杯狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

姜 雪,高玉偉,胡桂學,楊松濤,趙艷麗,劉秋燕,徐春忠,梁秀娟,夏咸柱

(1.吉林農業大學 動物科學技術學院,長春 130118;2.解放軍軍事醫學科學院 軍事獸醫研究所,長春 130062;3.上海野生動物園,上海 201300；4.吉林省野生動物救護繁育中心,長春 130122)

貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)為單股正鏈RNA,無囊膜,直徑30～40 nm[1],是一種貓和部分貓科動物普遍存在的病原體.易感動物感染FCV后表現為口腔潰瘍、上呼吸道感染、慢性口炎、鼻炎、結膜炎、肺炎或跛行等臨床癥狀[2-3]，其臨床癥狀的多樣性取決于FCV基因的多樣性[4],與由貓皰疹病毒(FHV)引起的貓傳染性鼻炎相似,二者也常混合感染[5].高致病性FCV可引起動物全身性感染,甚至死亡.感染FCV的貓一部分恢復健康,另一部分成為無癥狀的病原攜帶者[6].檢測FCV的方法有病毒分離鑒定和血清學實驗,對分離的病毒可通過電鏡檢查、RT-PCR、熒光定量PCR鑒定或與已知抗血清做中和、瓊擴、免疫熒光或補結實驗進行鑒定[1].其中熒光定量PCR方法應用廣泛[7-12],如Sykes等[13-14]建立了對FCV檢測的普通PCR方法;Helps等[15]用染料法建立了FCV熒光定量PCR檢測方法;Wilhelm等[16]以FCV的ORF2為目的基因建立了熒光定量PCR方法檢測FCV,最低檢測范圍為(5×101～5×102)拷貝/μL.本文通過優化FCV熒光定量PCR條件,為臨床樣品的檢測提供準確而快速的檢測方法.

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞

FCV由軍事獸醫研究所于2012年分離自國內某患病死亡的虎；貓鼻氣管炎病毒(FRtV)、貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)和貓腎細胞(F81)均為吉林農業大學動物科學技術學院實驗室保存.

1.2 主要儀器和試劑

德國Tiangen公司生產的Agilent Mx3000P型實時熒光定量PCR儀;美國ABI公司生產的PCR儀;德國Bio-Lmaging Systems公司生產的凝膠成像系統;美國Qnawell公司生產的核酸蛋白分析儀.

質粒小提試劑盒(D100)和瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒(D100)購自北京索萊寶科技有限公司;反轉錄試劑盒(AT301)和pEASY-Blunt載體(CB101-01)購自全式金生物技術有限公司;TRIZOL試劑(D9108A)、Pfu酶(D7336)、大腸桿菌感受態DH5α(D9057)、DL 2000 DNA Marker(D501S)和熒光定量PCR試劑盒(DRR390)等均購自大連寶生物工程有限公司.

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中編碼FCV衣殼蛋白ORF2的保守區基因序列,利用Primer5.0軟件,設計并合成一對特異性引物及探針.上游引物：5′-CTGACTTCAAATTTCATCTC-3′;下游引物：5′-TGGGAATTAAGTCAGAGG-3′;探針：5′-(FAM)ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC(Eclipse)-3′.探針以FAM為報告基團,以Eclipse為淬滅基團.引物及探針均由大連寶生物工程有限公司合成.

1.4 標準陽性模板的制備

用FCV病毒接種F81細胞,待細胞出現80%病變(CPE)后,反復凍融3次,收獲細胞毒.用TRIZOL法提取細胞毒RNA,提取產物直接進行反轉錄獲得病毒cDNA作為擴增模板.反轉錄體系：總RNA模板5 μL,隨機引物1 μL,2×TS反轉錄預混液10 μL,反轉錄酶RT 1 μL,去RNA酶水(DEPC)處理水補到20 μL.反應條件：25 ℃孵育10 min,42 ℃孵育30 min,85 ℃加熱5 min.PCR擴增體系：cDNA模板3 μL,5倍Pfu緩沖液10 μL,dNTP 3 μL,上游引物F 1 μL,下游引物R 1 μL,Pfu酶0.5 μL,DEPC處理水補到29.5 μL.PCR反應參數：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s,59.3 ℃ 20 s,72 ℃ 75 s,30個循環；72 ℃ 5 min,4 ℃保溫.以質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后,利用凝膠回收試劑盒獲得FCV病毒ORF2基因PCR擴增產物,將回收的產物連接pEASY-Blunt載體,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取陽性克隆菌搖菌,提取質粒,經PCR和測序鑒定.測定其OD值,并根據公式計算重組質粒的DNA質量濃度與純度.將重組質粒進行10倍梯度稀釋,保存備用.

分子拷貝數(個/mL)=DNA質量濃度/DNA分子量,DNA分子量=DNA堿基數×660,DNA質量濃度=A260g/μL×稀釋倍數×6.02×1023.

1.5 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

反應體系：DNA模板2 μL,EXTaq酶預混液12.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,探針1.0 μL,DEPC處理水補到25 μL.在Agilent Mx3000P型實時熒光定量PCR儀上反應,反應條件：95 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,45個循環；退火期收集熒光信號.用矩陣法在引物濃度為0.16,0.20 μmol/L,探針濃度為0.32,0.40,0.48,0.56 μmol/L的反應體系篩選引物和探針的最佳使用量,以獲得最低Ct值、典型熒光擴增曲線、較高熒光強度的引物和探針最佳濃度.

1.6 標準曲線的建立

實驗采用已優化的熒光定量PCR反應條件,分別以梯度濃度稀釋的含目的基因質粒為模板進行熒光定量PCR擴增,并利用Agilent Mx3000P型實時熒光定量PCR儀軟件進行分析,選取最佳濃度建立標準曲線.

1.7 特異性實驗及靈敏度與重復性實驗

用所建立的熒光定量PCR方法檢測FCV,FRtV,FPV,用雙蒸餾水作為陰性對照,以檢測其特異性.

將已計算出拷貝數的含目的基因質粒做10倍梯度稀釋,稀釋至用熒光定量PCR儀不能檢出的稀釋倍數,計算熒光定量PCR所能檢測的最低模板拷貝數.對同一陽性樣品進行4次重復檢測,通過組內重復的熒光擴增曲線變化及Ct值變化評估該方法的重復性.

1.8 疑似臨床樣本的檢測

用所建立的熒光PCR方法,對從長春市某寵物醫院收集的24份疑似FCV患病貓的咽試子樣本進行檢測.

1.9 病毒的分離與鑒定

將熒光定量PCR方法檢測結果為陽性的咽試子加適量DMEM稀釋后,于12 000 r/min離心10 min,取上清液加每毫升1 600單位的雙抗處理后接種單層F81細胞,盲傳5代觀察細胞是否產生特征性病變.對產生特異性病變的細胞反復凍融3次收取病毒液,進行RT-PCR鑒定.根據GenBank中已發布的FCV病毒ORF3基因序列設計一對特異性引物,預期擴增片段為550 bp,由北京博士生物公司合成.上游引物5′-TCCTTYGCAGTYTATAGAATAATTG-3,下游引物5′-TTATATCCCTGGGGTTAGGC-3′,Y: C/T.用TRIZOL法提取細胞毒的RNA,提取產物直接進行反轉錄獲得病毒cDNA作為擴增模板.反轉錄過程按說明書操作.PCR擴增體系：DNA模板2 μL,10×Taq緩沖液2.5 μL,dNTP 2 μL,上游引物F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,ExTaq酶0.3 μL,DEPC處理水補到25 μL.PCR反應參數：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30 個循環；72 ℃ 10 min,4 ℃保溫.反應結束后,取3 μL PCR產物進行質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

2 結 果

2.1 熒光PCR反應條件優化

圖1 引物和探針濃度的優化Fig.1 Optimization of the concentrations of primer and probe

采用矩陣法選取引物和探針的最佳濃度,結果如圖1所示.在c(引物)=0.20 μmol/L和c(探針)=0.40 μmol/L的條件下,對含目的基因質粒的檢測可獲得較合適的Ct值和較大的ΔRn.優化的熒光定量PCR反應條件為: 95 ℃ 30 s,95℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,循環數為45,退火階段收集熒光信號.

2.2 標準曲線的建立

按已優化反應條件,對103,104,105,106,107和108六個梯度含目的基因的質粒進行熒光定量PCR實驗,結果如圖2所示.由圖2可見,反應結束后所產生的標準曲線呈較好的線性關系.相應的拷貝數X與Ct值的線性關系為Ct=-3.288xlgX+46.72.

2.3 特異性實驗

用建立好的方法對FCV,FRtV,FPV的核酸及雙蒸餾水進行熒光定量PCR檢測,結果如圖3所示.由圖3可見,僅FCV產生熒光信號,呈現良好的特異性.

圖2 實時熒光定量PCR方法的標準曲線Fig.2 Standard curve of real time PCR

圖3 特異性實驗結果Fig.3 Test of specificity

2.4 敏感性實驗結果

將計算出拷貝數的質粒做10倍系列稀釋,進行熒光定量PCR實驗,結果如圖4所示.由圖4可見,熒光定量PCR檢測到的最低濃度為2.26×101拷貝/μL,表明該方法具有較高的靈敏度.

2.5 重復性實驗結果

對陽性樣品進行4次重復檢測,結果如圖5所示.通過統計分析可得變異系數為2.158%,表明該方法具有較好的準確性和重現性.

圖4 敏感性實驗結果Fig.4 Test of sensibility

圖5 重復性實驗結果Fig.5 Curves of repeat test

2.6 疑似臨床樣品的檢測及病毒分離鑒定結果

M：DL 2000分子量標準;1,2,3：PCR產物；4：陰性對照.圖6 RT-PCR結果Fig.6 Result of RT-PCR

用優化后的熒光定量PCR方法對24份疑似患FCV病貓的唾液樣品進行檢測,結果為陽性樣本3份,陰性樣本21份,FCV的檢出率為12.5%.采用F81細胞從熒光定量PCR陽性樣本中分離病毒,3 d后,細胞均出現圓縮、葡萄串樣和細胞脫落等病變.采用普通RT-PCR鑒定細胞培養物,結果均獲得預期核苷酸片段,如圖6所示.因此,本文建立的熒光定量PCR方法可較敏感地檢測出陽性樣本.

綜上可見,本文建立的FCV熒光定量PCR方法,檢測標準品的線性關系為0.992,最低檢測為2.26×101拷貝/μL,具有較高的敏感性；特異性實驗結果表明,該方法僅能檢測FCV,無法檢測其他相關病毒,呈現出良好的特異性；重復性實驗表明,批內變異系數為2.158%,重復性較好；臨床疑似樣品的檢測率為12.5%,與文獻[17]結果相符.

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