微流控芯片上電色譜聚合物整體柱研究進展

鄭暉，李秋順，馬耀宏，高廣恒，史建國

(山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院生物研究所，山東濟南250014)

微流控芯片(microfluidic chip)是上世紀 90年代初 Manz等［1］提出的以微機電系統(microelectromechanical systems，MEMS)技術為基礎的微全分析系統(miniaturized total analysis systems，μTAS)，也稱為芯片實驗室(lab on a chip)。在過去20年中，微流控芯片已經取得了長足的發展，這與毛細管電泳技術在芯片上的成功應用密不可分［2－5］。而隨著微加工和色譜技術的發展，微流控芯片技術逐漸應用于色譜這一常規分析中應用最廣泛的技術［6］中。芯片上的微色譜技術除具有色譜的優點外，還具有系統微型化、集成化和自動化的特點，有廣闊的應用前景。

由于微芯片上流體通道很細(幾十微米或更小)，填充固定相后流體阻力大，驅動流體所需壓力遠高于常規HPLC的壓力，芯片本身和色譜柱均難以承受，限制了機械泵驅動微芯片色譜的發展。而上世紀90年代，Ramsey研究組首次將毛細管電色譜(CEC)技術應用于微芯片平臺［7］，可利用電場產生的電滲流(electroosmotic flow，EOF)來驅動液體，避免了體系高壓。此后，微芯片電色譜逐漸受到了國內外研究者的重視［8－9］。

色譜柱是色譜分離技術的關鍵，由于微芯片尺度和性質的特點，微芯片上色譜柱與常規色譜柱存在不少差異。本文介紹當前在微流控芯片上應用的幾種主要的微色譜柱類型，并分析各自的優劣，重點綜述當前微流控芯片上電色譜聚合物整體柱的研究進展。

1 微流控芯片色譜柱類型

目前微流控芯片上色譜柱的類型主要有開管型色譜柱、填充色譜柱和整體柱等。

開管色譜柱的制作最為簡單。Jacobson等［7］在玻璃芯片微通道鍵合C18制成開管色譜柱，并用電色譜分離香豆素。Kutter等［10］在更短的通道中鍵合C18并縮短了分析時間。由于微芯片具有小管徑和淺通道的結構，此類色譜柱降低了塔板高度并提高柱效，但同時會導致柱容量降低，使系統容易過載，實用性不高。

相對于開管色譜柱，填充色譜柱有更高的比表面積和柱容量。同時，多種商品化的基體和填充材料方便了復雜樣品的分離分析，因此填充柱的應用更為廣泛。Gaspar等［11］利用彈性的PDMS材料，通過施加氣壓形成局部錐形截留結構，得到填充柱，其柱長和位置可通過改變壓力和填充時間來控制。填充色譜柱還被用于3種頭孢菌素類抗生素的電色譜分離［12］。Park等［13］采用溶劑蒸發法填充800 nm粒徑硅膠顆粒形成色譜柱，微球隨液體在毛細力作用下進入通道并自動聚集，填滿通道，他們在2 mm長的分離通道中15 s內分離了4種氨基酸。

填充柱的缺陷是填充不均勻，易導致峰拖尾、基線噪聲大和產生氣泡。近年來發展的多孔聚合物整體柱、硅膠整體柱等整體柱技術具有高通透性和高柱空間利用率，與填充柱相比優勢明顯［14］。

2 聚合物整體柱研究進展

聚合物整體柱從制作工藝上主要可分為三類，即原位合成整體柱、后修飾整體柱和結合微加工技術的整體柱。

2.1 原位合成聚合物整體柱

原位合成整體柱是將單體、交聯劑、引發劑溶于致孔劑，在一定溫度或紫外線作用下，于微芯片通道的原位合成聚合物，再沖洗除去致孔劑和殘余原料得到。

反相柱是微芯片色譜中應用最多的固定相。早期的毛細管色譜和微芯片色譜研究已經成熟地運用了原位合成的聚合物整體柱，常用的是以PMMA、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯為基礎的聚合物。近年來，研究者使用了很多新的單體來制備聚合物整體反相柱，如在PMMA類整體柱中使用肉桂酸、甲基丙烯酸丁酯、辛基甲基丙烯酸甲酯等［15］做為單體，新型的C14和C16的聚丙烯酰胺類整體柱［16］以及陽離子硬脂－丙烯酸酯［17］整體柱等。Bisjak等［18］利用原位共聚合制備了PA-PDA整體柱，該柱具有強機械穩定性，可用于分離蛋白和寡聚核酸。Li等［19］把單壁碳納米管與氯甲基苯乙烯(VBC)原位共聚合，得到新型整體柱。也有研究在芯片上集成多個組件形成聯合色譜系統，如Liu等［20］在芯片上通過原位聚合集成固相萃取柱和反相色譜柱，并用于富集、分離多肽和牛血清白蛋白酶解產物。

離子交換在電色譜中非常重要。Gu等［21］制備了磺酸基強陽離子交換整體柱，將該柱用于分離多肽時，其離子結合能力、峰容量、分辨率都非常高，但表現出相對強的疏水性。對于芯片電色譜而言，有強離子相互作用的離子交換柱非常重要。Wu等［22］利用原位合成法得到強離子交換柱，單體SEMA提供硫酸基團以產生電滲流，而聚合物上帶有的負電基團起到陽離子交換作用。由于該聚合物骨架的疏水性，該柱在分離多肽時，實質是反相/離子交換柱。Fu等［23］則用MEAMS和EDMA原位制備了反相/強陰離子交換柱，其表面的氨基具有產生電滲流和陰離子交換的作用，而疏水的骨架又能起反相柱的作用。

除研究可用單體外，新的工藝和制備方法的研究也取得了很大發展。通過調整單體、交聯劑、致孔劑之間的比例關系，研究者可以很好地控制所得到整體柱的通透性和柱效［24］。通過制備有濃度梯度的單體混合物溶液，還可以原位制備具有梯度的反相整體柱。具有梯度的整體柱與沒有梯度的整體柱相比，可以表現出更高的效率和分辨率［25］。還有的研究者改變了流道截面上只有一種柱介質的常規工藝，利用孔層開管柱(porous layer open-tubular，PLOT)的方法在截面上制備出多種柱介質的整體柱［26］，并成功用于分離生物樣品。這種方法不但提供了很好的通透性，也顯著提高了峰容量。

雙親性和兩性聚合物近來也更多地運用到芯片電色譜柱的制備中［27］。含有疏水和親水基團的聚丙烯酰胺整體柱就是典型的雙親性柱，可以用作正相或反相柱。Hoegger和Freitag［28］制備了帶有磺酸基的雙親性聚丙烯酰胺整體柱，并用于帶電氨基酸和多肽的電色譜分離。

2.2 后修飾聚合物整體柱

原位聚合得到的整體柱并不總是能滿足特定的色譜分離需求。在原位聚合時，很多功能團會包埋在顆粒內部，而不在表面上，因此柱性能會明顯降低。采用后修飾的方法在柱表面生成功能團則會大大改善這一問題。

聚合物整體柱的后修飾方法很多，使用最多的方法是在聚合物表面接枝。利用環氧、芐氯等［29］基團接枝的方法報道比較早，近年，利用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的環氧基團的接枝方法較為流行，并成功運用到離子交換色譜、親和色譜、pH梯度色譜等芯片色譜柱的制備中。

反相柱的后修飾需求并不多，但Li等［30］利用簡單方法在整體柱表面修飾C18基團，以提高蛋白質分離的分辨率和通量，從而用于蛋白質組學研究。Dong等［31］在GMA柱上固定了賴氨酸。當分離電中性分析物時，起到反相柱的作用。而對于帶電分析物，靜電相互作用、電泳遷移作用和疏水相互作用則共同生效。

用于芯片電色譜的后修飾離子交換柱也有報道。Bisjak等［32］在GMA柱上接枝氨基得到陰離子交換柱。Wieder等［33］發展了這一方法，使用兩步法獲得了類似機制的強陰離子交換柱。Wei等［34］通過在GMA上接枝制備了一種弱陽離子交換柱，其離子交換表面是通過一個胺化的過程得到。

除利用環氧基團開環反應的方法，其他的接枝方法也有相應研究。二苯甲酮經紫外線照射后，可引發接枝反應，如Rohr等［35］在聚BMA-co-EDMA聚合物柱表面修飾AMPS，并成功用于分離多肽。Hilder等［36］則把兩層不同功能的多聚物鏈連接，得到新的功能表面。

相對于接枝的方法，把功能化的納米顆粒包被在聚合物的表面的方法較為簡單，也常用于制備功能化聚合物柱。Hilder等［37］在聚BMA-co-EDMA-co-AMPS的表面包被了直徑為60 nm的季銨鹽納米顆粒，制備了陰離子交換柱用于分離多糖。掃描電鏡圖像表明聚合物表面的多孔結構在修飾前后無變化，因而可以證實所修飾納米顆粒的陰離子交換作用。基于類似方法，Hutchinson等［38］和Zakaria等［39］實現了無機陰離子的分離，其洗脫順序表明所修飾的納米顆粒同時具備粒子交換和幫助電泳的機制。

2.3 結合微加工的聚合物整體柱

通過微加工技術可以在芯片微通道內形成高度整齊的微結構(collocated monolith support structures，COMOSS)［40］(見圖1)，作為固定相載體，這種微加工整體柱是芯片色譜柱所獨有的。COMOSS的設想最初是由Regnier等［41］提出的，他們首次采用深度反應離子刻蝕技術(Deep Reactive Ion Etching，DRIE)，在微芯片上加工了32條高深寬比的微柱陣列，總寬度為120 μm。在總寬度為1.2 cm的微芯片上，COMOSS總數超過4×105個。然后在微柱表面上采用靜電法涂覆了聚苯乙烯磺酸，制得了反相電色譜柱。這樣規整微結構填充的色譜柱，被認為可優化獲得接近于理想的流體形態，以及降低混合(擴散)效應，從而獲得更高的分離效率［42］。He等［43］通過分析卵清蛋白酶解產物的分離效果，對比了C18修飾前后的微加工整體柱，結果表明反相涂層顯著改善了分離效果，且在芯片上的分離速度比常規的液相色譜梯度洗脫更快。Lavrik等［44］通過優化的BOSCH刻蝕工藝，獲得了柱徑0.8～1.6 μm、深寬比25:1的微加工整體柱，其理論塔板數為1.3×106/m。

硅片基質的微加工整體柱價格昂貴，因此有研究者在廉價材料上進行了此類探索。Slentz等［45］發展了一種微加工整體柱的制備技術，能在廉價的PDMS芯片上制備尺度為10 μm的多組微結構，并在微結構表面鍵合C18硅烷以對異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白酶解產物進行電色譜分離，分離多肽的理論塔板數達到4×105/m。隨后，Slentz［46］等還在 PDMS 柱表面修飾了 2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸等5種聚合物涂層，用于分離BSA的酶解產物，理論塔板數達6.2×105/m。

碳納米管等納米材料以及氣相沉積法等加工技術，也被利用來制作芯片上的微結構，作為固定相的載體。Fowlkes等［47］將垂直排列的碳納米管原位生長于石英基底，形成微柱結構排列的COMOSS，以增加相比，從而提高分離效率。Mogensen等［48］以乙炔－氨氣作為碳源，采用等離子體增強的化學氣相沉積技術和鎳種子層，在硅芯片通道內生長了碳納米管纖維。其表面帶負電荷，產生的電滲流方向與玻璃相同，可將熒光素和5-羧基熒光素分離。Goswami等［49］利用二茂鐵為催化劑，以乙烯為碳源，采用化學氣相沉積方法，在石英微通道內得到緊密的纖維狀碳納米管纖維，制備得到了反相色譜柱，并成功分離了硫脲和肽的混合物。

圖1 微加工整體柱的進樣口結構［42］Fig.1 Inlet splitter structure of COMOSS ［42］

3 結論

芯片電色譜應用價值很大，將多種功能整合在微流控芯片上并用于色譜分離，將充分展示微流控芯片的巨大潛力。由于微芯片本身存在尺度限制，微芯片上的開管柱存在分離效率低的缺陷，填充型色譜柱也存在很多問題。相對而言，聚合物整體柱具備諸多優點，且其制備過程容易與微芯片相結合，是微芯片色譜柱的一個方向。

原位合成聚合物色譜柱方法最為直接，根據要求的不同，研究者已經開發了很多的單體材料和制備工藝。對于一般分離需求，這種方式是很好的選擇。采用后修飾的方法在固定相表面連接功能基團可以提高柱分離效果，但這些修飾的反應條件往往不夠溫和，用于PDMS等化學耐受性不夠好的芯片材料時會受到限制。而引入一些微加工技術，就可以在微流控芯片設計時制造出精細的微結構，然后在這些微結構上得到聚合物整體柱，從而充分發揮微流控芯片微色譜的諸多優勢。

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