精子體外處理方法與技巧

周世敏 李艷萍 鄔伶仟 劉冬娥 劉能輝 姚仲元 陳仙花 張葉青

本文將對本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年來進行體外受精-胚胎移植治療的夫婦進行臨床研究，從而探討精液體外處理方法及技巧，為臨床提高體外受精-胚胎移植治療不孕不育癥患者療效以及優質胚胎率提供可靠依據，現報告結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本文將對本院2010年1月1日-2012年9月30日近三年來進行體外受精-胚胎移植治療的夫婦進行臨床研究，其中2010年1402例，男平均（31.4±0.5）歲，女平均（29.7±0.8）歲，不孕不育癥平均病程（5.6±0.5）年；2011 年 1667 例，男平均（31.9±0.5）歲，女平均（30.3±0.7）歲，不孕不育癥平均病程（5.1±0.8）年；2012年1321例，男平均（32.1±0.6）歲，女平均（30.5±0.8）歲，不孕不育癥平均病程（5.2±0.6）年。2010年IVF-ET取卵周期數為1402例、2011年1667例、2012年（1-9月）1321例。

1.2 方法 對2010年1月1日-2012年9月30日近三年來進行體外受精-胚胎移植治療的夫婦臨床資料進行回顧性分析，2010年取卵周期數為1402例實施部分上游法及部分密度梯度離心法對精液進行處理；2011年取卵周期數為1667例實施大部分梯度密度離心法+上游法以及少部分上游法對精液進行處理；2012年取卵周期數為1321例實施全部梯度密度離心+上游法對精液進行處理。觀察并記錄各年份患者受精情況，進行統計學分析，得出結論。

1.2.1 采樣處理 女方給予常規促排卵方案，于體內卵泡發育成熟后對其肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（即hCG）[1]，劑量為5000或10 000 IU，32～36 h后，經陰道超聲引導下對女方進行穿刺取卵[2]。男方于女方取卵當日通過手淫法取精液[3]，取精液前男方禁欲3～7 d[4]，將精液收集在無菌塑料杯中液化后待用。

1.2.2 上游法[5]取將液化后的精液，加入2～3 ml Vitorlife公司生產的HTF洗滌液進行混合，之后以每分鐘2000轉速度離心3～5 min，棄上清液后加入試管底部并在上層加入2 ml培養液，經濃度為5%、37℃二氧化碳培養箱中上游30～40 min，之后取上清液離心3～5 min，棄上清液后待用。

1.2.3 密度梯度離心+上游序貫法[6]對精液進行處理，選用Vitorlife公司生產的Isolate梯度分離液，在15 ml圓錐離心管首先將濃度為90%、劑量為1 ml的Isolate分離液注入，之后在其上方加入濃度為45%、劑量為1 ml的Isolate分離液，最上層也輕輕緩慢加入液化的精液，離心速度為每分鐘2000轉離心10 min棄上清，用劑量為2 ml的HTF洗滌液把上述所得沉淀物輕輕混勻，離心速度為每分鐘2000轉離心3～5 min棄上清，下懸液加入試管底部，在上面加入2 ml培養液，于濃度為5%、37 ℃二氧化碳培養箱中上游30～40 min將其吸出，每分鐘2000轉速度離心3～5 min，棄上清后待用。

1.2.4 受精措施 患者取卵完成后，對其進行黃體酮肌肉注射以便支持黃體[7]，于胚胎移植完成2周后進行尿液試驗，結果為人絨毛膜促性腺激素呈陽性，于4周后對患者進行B超臨床醫學影像觀察，若患者體內出現妊娠囊及胎心搏動，則可確診為臨床妊娠[8]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

體外受精-胚胎移植治療結果分析，見表1。由表1可知，本院自2010年-2012年，臨床妊娠成功率呈現出逐年上升趨勢，結果比較差異具有統計學意義（P<0.05）。

表1 近三年內體外受精-胚胎移植治療不孕不育癥結果分析

3 討論

目前臨床上常借助輔助生殖技術對不孕不育癥患者進行治療，常規治療方法為體外受精-胚胎移植（簡稱IVF-ET）[9]。臨床研究表明，對不孕不育癥患者進行IVF-ET技術治療時，由于實施卵漿內單精子注射（簡稱ICSI）方式，精子將繞過自然選擇過程，直接被注入卵母細胞內，因此部分發生遺傳物質受損的精子有可能直接注入卵子內部，從而對胚胎發育造成影響，嚴重時可導致患者孕育后代時出現遺傳風險，造成嚴重后果[10]。

應用精液體外處理注意事項：在取精前數月，男方應戒煙酒，生活有規律，如有生殖系統炎癥需積極治療。進入治療周期后，根據醫囑在估計取卵前3～7 d，其丈夫需排精一次，然后禁欲，直至取卵日，精液在體內存留時間過長或過短會影響精子質量。首先用清水洗凈雙手，陰莖，外陰等，然后手淫法留取精液時所用小杯為無菌消毒，留取時不要觸摸杯緣及杯內。取精后對其進行液化后應盡快使用，其原因為液化時間過長，精子核易出現空泡現象，影響精子質量，精子核空泡的形狀和數目對囊胚的發育有負面影響，精子頭部的空泡可能與移植后的流產率相關。由于人精子頂體部含有大量不飽和脂肪酸，并且缺乏抗氧化機制，處理精液時較大的離心力可增加精子產生過多氧自由基（ROS）而損傷精子功能，特別是促使精子的DNA氧化變性，因此在對精液行離心時應盡量減少離心時間及轉數，從而盡量避免精液中精子損傷情況發生。

在本次研究過程中對精液應用洗滌液進行洗滌目的為：（1）去除精液中的前列腺素及其他可引起子宮痙攣及疼痛的物質。（2）去除精液中可引起感染及其他副作用的細菌和化學物質。（3）增加了精子的獲能，從而增強其受孕能力。（4）有可能去除影響精子功能的抗體。

Pereoll法和Isolate法是臨床常用的精液體外梯度密度離心處理方法，但Isolate法處理效果優于Pereoll法，其原因為：（1）Percoll中含有聚乙烯吡咯烷酮在離心過程中可加速精子膜過氧化反應導致DNA完好性受損；（2）Isolate精子分離液是一種非連續液態過濾膜，為二氧化硅以共價鍵形式交錯聯結于Hepes-HTF，是經特殊處理的懸浮膠體密度梯度介質，可有效減少細胞污染，與待分離精子不發生反應，不易使頂體膜蛋白失活[3]，具有保護精子DNA結構免受損傷作用，另一方面可能是Isolate所含有的二氧化硅膠體兼作支持體與分子篩的作用，對離心力有緩沖作用，使對精子潛在的氧化損傷降至最低。

[1]Dada R，Shamsi M B，Venkatesh S，et al.Attenuatlon of oxidative stress & DNA damage in varicocelectomy：Implications in infertility management[J].Indian J Med Res，2010，132（6）：728-730.

[2]楊俊濤，王亞平，黃國寧，等.兩種精子優選法對精子DNA結構完整性及其它參數的影響[J].激光雜志，2009，30（6）：90-91.

[3]Peter R.Brinsden Texmook of In vitro fertilization And Asslsled ReDroductlon[M].北京：人民衛生也版社，2009：22-234.

[4]丁玉芹，姜宏，何瑞冰，等.DNA損傷精子對卵胞質內單精子注射結局的影響[J].安徽醫科大學學報，2011，46（2）：173-176.

[5]盧慧，劉玉林，李錚.男性不育臨床檢測新選擇：精子DNA完整性試驗[J].中國男科學雜志，2009，23（1）：70-72.

[6]袁韋娜，姜宏，汪存利，等.精子DNA完整性與精子形態的相關性研究[J].生殖醫學雜志，2010，19（3）：271-273.

[7]曹云霞.精子染色質完整性檢測與輔助生殖技術[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2011，30（1）：58-60.

[8]張楊，皮潔.輔助生殖技術中精液處理[J].中國優生與遺傳雜志，2010，18（8）：126-127.

[9]乜照燕，吳海峰，張娜，等.男性年齡對精子氧化應激水平、核DNA損傷的影響[J].中國計劃生育學雜志，2012，20（1）：30-32.

[10]吳永明，夏欣一，黃宇烽.精子DNA完整性檢測技術研究進展[J].中華男科學雜志，2006，12（8）：737-741.