竹葉青素的基因合成、原核表達及生物學功能的初步研究

齊元麟，張明芳，胡建石，徐劍文，林建銀

(福建醫科大學1.基礎醫學院分子醫學研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，2.生理學與病理生理學系，3.人體解剖學與組織胚胎學系，福建 福州 350004)

整合素(integrin)是細胞膜上一類重要的跨膜糖蛋白，介導細胞間及細胞-基質間的黏附，控制細胞的增殖、凋亡和分化，而影響胚胎發育、創傷愈合及腫瘤生成和轉移等過程［1-2］。去整合素(disintegrin)是蛇毒中一類含有RGD模體的多肽，能阻斷整合素與配體的結合，具有抑制血小板聚集、抑制骨吸收及抑制腫瘤轉移與血管新生等生物學功能［3-5］，其藥物開發潛力引起關注［6-8］。

本研究選擇來自竹葉青(Trimeresurus stejnegeri)的trigramin(竹葉青素)作為研究對象，合成竹葉青素基因并在大腸桿菌中表達、純化和鑒定，同時從竹葉青蛇毒中分離純化天然竹葉青素作為對照，為研究蛇毒去整合素生物學活性和可能的開發應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人膀胱癌細胞株ECV304由本實驗室保種，培養條件為:含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃和5%CO2飽和濕度培養。

1.2 主要試劑 竹葉青蛇毒，淡黃色凍干粉，產地:江西;胎牛血清，杭州四季青公司;DMEM培養基、青鏈霉素，Invitrogen公司;BL21工程菌、pET-42a載體、BugBuster HT、rLysozyme、還原型谷胱甘肽，羅氏公司;Spe I、Xho I限制性內切酶，New England Biolabs公司;CCK-8試劑盒，同仁化學研究所;GSTrap FF親和層析柱、Sephacryl S-300分子篩層析柱，GE Healthcare公司;Lichrospher C18層析柱，Merck公司。其余試劑均為進口或國產分析純。

1.3 竹葉青素全基因合成 將竹葉青素Trigramin序列(NCBI accession number:X51530.1)分為相互重疊的4個片段，分別合成相應寡核苷酸A、B、C、D，并設計相應引物 ABF、ABR、CDF、CDR。取 A、B、ABF、ABR 各10 pmol加入1×PCR Buffer中，100℃變性2 min，在2.5 h內緩慢退火至37℃，然后加入Taq酶，常規PCR擴增拼接AB片段。如法拼接CD后，利用合成的AB和CD片段進一步拼接完成全序列。產物進一步克隆入pUC19載體，并經測序驗證。引物序列見Tab 1。

Tab 1 List of primers for gene synthesis

1.4 竹葉青素的原核表達 將Trigramin從pUC19載體亞克隆到pET-42a表達載體的Spe I和Xho I位點，抽提質粒，轉化工程菌BL21，篩選單克隆接種至搖瓶，以2.5 mmol·L-1IPTG誘導蛋白表達。Phoretid 1D軟件分析蛋白相對表達量。

1.5 重組竹葉青素的純化 重組竹葉青素轉化菌和空質粒pET-42a轉化菌經IPTG誘導4 h后，離心收集細菌沉淀并稱重，加入BugBuster HT裂解細菌(每克菌體加入5 ml試劑)，同時加入溶菌酶(rLysozyme)至終濃度1 kU/ml，溫和裂解，去除沉淀，上清液上樣于GSTrap FF親和層析柱，以Tris緩沖液(50 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1還原型谷胱甘肽)洗脫目的蛋白。

1.6 天然蛇毒中竹葉青素的分離純化 竹葉青粗毒0.5 g溶于5 ml 0.05 mol·L-1的Tris緩沖液(pH 8.0)，16 000×g離心15 min，棄去不溶的沉淀，取上清液上樣于Sephacryl S-300預裝柱(2.6 cm×60 cm)，在AKTA prime純化系統上進行凝膠過濾層析。將分子篩分離得到的具有抑制血小板聚集活性的組分上樣于Lichrospher C18 4.6/250反相色譜柱，經兩次反相高效液相色譜分離，得到純化的竹葉青素。SDS-PAGE鑒定蛋白均一性。

1.7 血小板聚集實驗 人的靜脈血樣采自健康志愿者的肘前靜脈，離心法制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。用PPP稀釋PRP使血小板終濃度為3×108·L-1。在200 μl PRP中分別加入不同濃度的天然或重組竹葉青素，在MPG-3E血液凝聚儀中測定血小板聚集率。計算抑制率的公式如下:

繪制劑量-效應曲線，求得半數抑制濃度(IC50)，IC50定義為聚集受抑制達到最大值的一半時的竹葉青素的終濃度。

1.8 細胞增殖實驗 取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液(1×108·L-1)，接種至96孔板，每孔100 μl，每組細胞設5個復孔。37℃和5%CO2實驗條件下常規培養。對照組為完全培養基，Trigramin組、GST-Control組和GST-Trigramin分別為含10 mg·L-1天然竹葉青素、100 mg·L-1GST對照蛋白和100 mg·L-1重組竹葉青素的完全培養基，d 1、2、3、4、5分別取出一塊板檢測，每孔加入 CCK-8 10 μl，37℃培養1 h后，酶標儀上檢測450 nm處的光吸收度，繪制細胞生長曲線。

1.9 細胞劃痕實驗 用250 μl/well的Fibronectin(10 mg·L-1)包被24孔培養板，37℃孵育2 h，超凈臺風干1 h，每孔加入250 μl含0.1%BSA的無血清培養液，37℃孵育1 h。將常規傳代的細胞消化洗滌后，以每孔2×105個的密度接種入包被好的24孔板，細胞融合后換成無血清培養基培養12 h，使細胞同步化。用移液器吸頭沿培養板底部呈“一”字型劃痕，鏡下記錄劃痕區相對距離，PBS輕輕洗滌兩次以去除細胞碎片，無血清培養液洗滌后，更換含2%血清的培養基(實驗組分別為含2%血清的10 mg·L-1天然竹葉青素、100 mg·L-1GST對照蛋白和100 mg·L-1重組竹葉青素)，培養24 h，觀察劃痕區細胞的生長情況。

1.10 統計學分析 所有數據均采用SPSS軟件進行統計學處理，實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2)暴雨過程MCS的發展有多種組織方式,東西向雨帶不斷的后部建立型和隨后對流單體的列車效應是6月26日夜間到凌晨MCS發展的主要方式。27日凌晨到早晨,對流元向東北—西南向發展形成多個近乎平行的東北—西南向雨帶,有2種尺度的對流組織方式:一種是新生對流單體沿著每個雨帶向東北方向移動的列車效應,另一種是雨帶沿著線狀MCS向東平流的“列車帶效應”。27日白天,梅雨鋒鋒面雨帶中東北—西南向短雨帶的不斷東移是降水持續的原因。

Fig 1 Gene synthesis and E.coli expression of snake venom disintegrin Trigramin

2 結果

2.1 竹葉青素基因合成及原核表達 采用緩慢退火-PCR方法，將片段引物拼接成完整的竹葉青素基因，并克隆入pUC19載體，經測序驗證無誤。將基因亞克隆至原核表達載體pET-42a，在BL21菌株中用IPTG誘導表達，空白質粒轉化組表達出GST對照蛋白(38.5 ku)，重組竹葉青素轉化組表達出融合蛋白GST-Trigramin(35.9 ku)，而未誘導組在相應位置無表達，蛋白表達量占菌體總蛋白比例分別為31.5%(GST對照)與40.7%(Trigramin)，見 Fig 1。

2.2 重組竹葉青素的純化和鑒定 BugBuster抽提到的菌體可溶蛋白經親和層析純化后，對照蛋白在38 ku、重組蛋白在36 ku附近呈現出一條蛋白主帶，與GST對照蛋白及GST-Trigramin融合蛋白的大小一致，純度分別為83.2%和89.1%。見Fig 2。

2.3 天然竹葉青素的純化和鑒定 竹葉青蛇毒經Sephacryl S-300分為5個峰，其中Ⅳ峰和Ⅴ峰具有抑制血小板聚集能力，收集Ⅳ峰，經兩次反相HPLC分離，得到單一峰。經SDS-PAGE鑒定為均一組分，分子質量為8.5 ku。見Fig 3。

Fig 2 Purification of GST-Trigramin by GST-bind affinity chromatography

2.4 竹葉青素對血小板聚集的影響 天然和重組竹葉青素均可抑制ADP誘導的血小板聚集，且呈明顯的劑量-效應關系，而GST對照蛋白不能抑制血小板聚集。天然竹葉青素半數抑制濃度(IC50)為3.0 mg·L-1(0.35 μmol·L-1)，重組竹葉青素的IC50為 28.2 mg·L-1(0.78 μmol·L-1)。見 Fig 4。

2.5 竹葉青素對細胞增殖的影響 10 mg·L-1天然竹葉青素、100 mg·L-1GST對照蛋白和100 mg·L-1重組竹葉青素均不影響ECV304細胞增殖，各組數據統計差異無顯著性，見Fig 5。

2.6 竹葉青素對細胞運動的影響 10 mg·L-1天然竹葉青素和100 mg·L-1重組竹葉青素可抑制劃痕的愈合，而100 mg·L-1GST對照蛋白不能抑制細胞運動，說明重組竹葉青素抑制細胞運動的功能來自其去整合素結構域。見Fig 6。

Fig 3 Purification of native trigramin from crude venom of Trimeresurus stejnegeri

3 討論

去整合素在蛇毒中含量甚微，克隆其基因并在各種表達系統中表達重組蛋白，是研究其生物學功能并進一步開發利用的有效手段。本研究首先合成竹葉青素基因，以GST融合蛋白形式在大腸桿菌表達系統中獲得高效表達，重組蛋白產量占菌體總蛋白量的37.6%;隨后采用親和層析技術純化重組融合蛋白，得到了純度為89.1%的重組 GST-Trigramin，為研究其功能奠定了基礎。GST是原核表達中常用標簽，它在菌體內高度可溶并能協助融合蛋白的折疊，有助于獲取有活性的重組蛋白。Seoane［9］和 Teklemariam［10］分別用 GST 融合蛋白形式在原核體系表達了小盾響尾蛇(Crotalus scutulatus scutulatus)去整合素mojastin和銅頭蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)去整合素樣肽 acocostatin，并探討了它們誘導腫瘤細胞和內皮細胞凋亡的功能，發現GST融合去整合素在原核表達體系中能夠正確折疊并具有生物學活性。

Fig 4 In vitro inhibition of ADP-induced aggregation of normal human PRP by native and recombinant trigramins

Fig 5 Effects of native and recombinant trigramins on ECV304 cell proliferation

Fig 6 Effects of native and recombinant trigramins on in vitro cell motility

本研究顯示，重組GST-Trigramin能抑制血小板聚集和細胞遷移，其抑制ADP誘導的血小板聚集的IC50為 0.78 μmol·L-1，而從蛇毒中純化得到的竹葉青素抑制血小板聚集的IC50為0.35 μmol·L-1，說明重組GST-Trigramin能夠折疊成活性結構，但其活性與天然純化的蛋白有一定差別，其原因可能為①重組竹葉青素不能100%折疊為天然結構，②GST結構域干擾了竹葉青素與底物的結合，但具體機制仍有待進一步研究。本研究進一步探討竹葉青素對人膀胱癌細胞ECV304增殖和運動的影響，發現天然和重組竹葉青素均不影響腫瘤細胞增殖，但可抑制腫瘤細胞的體外運動能力。Ramos［11］發現特異性抑制αvβ3的去整合素DisBa-01，可抑制黑素瘤轉移和bFGF介導的血管新生，Tian等［12］發現去整合素eristostatin可抑制纖粘連蛋白與細胞的結合，而抑制腫瘤細胞的活動能力，竹葉青素抑制細胞運動可能也通過類似的機制。

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