阿托伐他汀促進體外培養大鼠乳鼠皮層神經元樹突生長及突觸相關蛋白表達

郁盛雪，屈文慧，隋海娟，金迎新，金向楠，金 英

(遼寧醫學院1.藥理學教研室、2.2008級臨床醫學專業學生，遼寧 錦 州 121001)

神經元樹突的功能是接收整合臨近神經細胞的傳入信息，其長度和分支可反映細胞的功能狀態，而許多營養因子和應激可影響樹突發育，進而影響神經環路的形成和功能［1］。樹突棘是樹突分支上的棘狀突起，是神經元間形成突觸的主要部位，其形態變化與學習記憶密切相關［2－3］。在一些退行性疾病中，如阿爾采末病(Alzheimer disease，AD)，其主要病理改變是神經元，突觸的缺失以及突觸－軸突的病理性改變。因此，促進神經元樹突生長的藥物可能對神經退行性疾病的治療和預防有著重要的意義。突觸蛋白(synapsins)是一組與突觸相關的具有神經元特異性的磷酸蛋白，它作為突觸的特異性標志物用于AD的研究，突觸素(SYP)是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質，參與了中樞神經系統突觸連接的形成和維持。突觸后致密蛋白95(PSD-95)是位于谷氨酸能突觸PSD中的一種膜相關蛋白，可通過不同結構域與其它蛋白相互作用，串集NMDA受體及其信號通路中的相關蛋白，組成受體-信號分子靶分子復合物，在信號轉導中起關鍵作用［4］。兩者作為突觸的特異性標志物，是突觸核心構建蛋白，在維持突觸正常功能和可塑性方面具有重要作用。他汀類藥物屬羥甲戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，是已知作用最強的降膽固醇藥物。阿托伐他汀(Ato)屬于他汀類藥物，現廣泛用于臨床，并呈現出生物效應的多效性，包括抗氧化、抗炎癥、抗血小板聚集、抗腫瘤生長、改善內皮細胞等。目前，有很多證據顯示他汀類藥物有不依賴于其降脂作用的神經細胞保護作用［5－8］。現已有研究證實進展性腦梗死早期應用Ato可縮短腦梗死損害加重的達峰時間，可改善預后，具有神經保護作用。一些在體實驗已經證實Ato可以減少神經元凋亡［9－10］。而Ato對大腦皮層神經元樹突生長及突觸相關蛋白表達的影響，國內外報道罕見。本研究應用體外培養皮層神經元細胞觀察Ato對正常皮層神經元樹突生長及突觸相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 阿托伐他汀(#23922105，純度 ＞98%)購于LKT公司，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解。DMEM、F12培養基購于 Invitrogen 公司、DMSO、Hoechst 33258、胰蛋白酶(Trypsin，1 ∶250)、L-多聚賴氨酸(Poly-L-lysine，#P2636)均購于Sigma公司;新生胎牛血清、馬血清購于廣州蕊特生物科技有限公司;HEPES(#391338)購于Calbiochem公司;阿糖胞苷購于意大利S.P.A公司;鼠SYP單克隆抗體、兔PSD-95多克隆抗體、山羊抗兔、山羊抗鼠二抗、鼠抗微管相關蛋白-2(MAP2)單克隆抗體及NeuN多克隆抗體和GFAP抗體購自Santa Cruz公司;β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于Beyotime試劑公司;Super Signal West Pico化學發光底物購于美國Thermo Scientific公司。其他相關試劑均由遼寧醫學院藥理實驗室提供。

1.2 大腦皮層神經元原代培養 取出生0～24 h Sprague-Dawley大鼠乳鼠［動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007，遼寧醫學院動物實驗中心提供］，體積分數為75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出大腦皮層，置于培養基中，剔除血管和軟腦膜，剪成1 mm3左右的小塊。加入0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min。待細胞分散后，加入含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養基終止消化。200目篩網過濾，1 000×g離心10 min，用含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養基制成細胞懸液，調整細胞密度為 1×108～1×109·L－1，接種在鋪有L-多聚賴氨酸24孔或6孔培養板中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。培養48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg·L－1)的培養基，抑制非神經細胞增殖。以后每2天換液1次，培養4 d后用于實驗。應用NeuN抗體和GFAP抗體進行免疫熒光染色鑒定，結果顯示神經元培養純度在90%以上。

1.3 細胞分組及處理 本實驗分為三部分:第一部分觀察不同濃度Ato處理組對樹突生長的影響，細胞分為對照組，加入含等量0.1%DMSO培養基;Ato處理組，培養4 d 神經元加入 Ato(0.1、1、5、10 μmol·L－1)作用48 h;第二部分觀察Ato處理不同時間組對樹突生長的影響，細胞分為對照組，加入含等量0.1%DMSO培養基;Ato處理不同時間組，將Ato 5 μmol·L－1加入培養4 d 神經元，分別作用12、24、48 h;第三部分檢測Ato不同濃度處理組(0.1、1、10 μmol·L－1)作用 48 h 對 SYP、PSD-95 蛋白表達的影響;檢測 Ato 1 μmol·L－1時處理不同時間組(12、24、48、96 h)對 SYP、PSD-95 蛋白表達的影響。

1.4 神經元樹突形態學觀察分析 體外培養神經元用配置CCD和Tsview軟件的Olympus CKX41型倒置相差顯微鏡，結合MAP2免疫熒光染色，用10倍或20倍物鏡觀察以確保將1個神經元拍攝到1個視野中，分析時采取了Ohara和Havton的命名法［11］:從胞體直接伸出的樹突分支為一級分支，用Image J軟件測量，隨機選取的1個神經元TDBL，并計數這個神經元PDN。計數樣本來自3個不同批次培養的神經元，每批次選取10～15個細胞。為了減少實驗誤差，實驗采取雙盲方法進行。

1.5 免疫熒光染色檢測SYP、PSD95表達 培養7 d的皮層神經元，移去培養基，用冷的PBS漂洗3次;用新鮮配置的4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min;0.3%Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min;室溫下3%山羊血清封閉30 min;加入MAP2、SYP、PSD-95抗體 (1∶100)4℃過夜，PBS漂洗后，加入異硫氰酸熒光素(FITC)或羅丹明(TRITC)標記的二抗作用2 h，PBS漂洗后Hoechst 33258核復染10 min。熒光倒置顯微鏡下檢測MAP2、SYP、PSD-95表達。

1.6 Western blot檢測 SYP、PSD95蛋白表達水平原代培養的皮層神經元，經各種藥物處理不同時間后，用冷的PBS沖洗，立即放入預冷的裂解緩沖液中(1%Triton，0.1%SDS，0.5%Deoxycholate，1 mmol·L－1EDTA，20 mmol·L－1Tris(pH 7.4)，150 mmol·L－1NaCl，10 mmol ·L－1NaF，1 mmol·L－1Na3VO4，0.1 mmol·L－1PMSF)，4℃ 超聲粉碎后，12 000×g離心30 min，取上清，用BCA法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，將各組蛋白濃度調成一致。用10%～12%的SDS-PAGE分離蛋白質，每個泳道蛋白上樣量為20 μg。為了準確判斷目的蛋白帶的位置，一個泳道加See Blue Plus 2預染蛋白標記物，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用TBS［10 mmol·L－1Tris(pH 8.0)，150 mmo·L－1NaCl］洗膜 3次，每次10 min。將膜放入一抗中(1∶1 000)，4℃過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗(1∶1 000)中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min，將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學發光凝膠系統分析儀中進行ECL化學發光。測定SYP、PSD-95。每個抗體測定時都進行β-肌動蛋白測定，以保證蛋白上樣量的一致性。利用Visionworks 6.3.3.圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析。實驗重復3次。

Fig 1 Effect of atorvastatin on the growth of dendrite cultured cortical neurons in vitro

2 結果

2.1 阿托伐他汀對培養皮層神經元樹突的影響應用倒置相差顯微鏡和MAP2免疫熒光染色，觀察發現Ato處理組(Ato 5 μmol·L－1)可促進皮層神經元樹突生長(Fig 1);應用Tsview軟件測量神經元TDBL和PDN，結果Ato能促進皮層神經元TDBL、PDN增加(Fig 1)。

2.2 阿托伐他汀處理不同時間對皮層神經元樹突的影響 根據不同濃度Ato處理組對樹突的影響，我們選用Ato的最佳濃度5 μmol·L－1加入培養4 d神經元分別作用12、24、48 h，結果顯示，Ato作用24 h，就可使培養神經元TDBL和PDN均明顯增加，Ato作用48h后TDBL、PDN進一步增加 (Fig 2)，但Ato 12 h這種作用不明顯。

Fig 2 The quantitative analysis of the results of TDBL，PDN affected by atorvastatin at different time points in each group(n=30)

2.3 阿托伐他汀對皮層神經元突觸素和突觸后致密蛋白95蛋白表達的影響 Fig 3結果顯示，正常對照組SYP、PSD-95呈特征性顆粒狀或點狀分布于胞體周圍和沿著神經元突起分布，染色淺且熒光表達強度較暗(Fig 3A、C)。Ato(5 μmol·L－1)作用48 h可使SYP和PSD95表達量明顯增多，點狀小顆粒連成細絲，能映襯出突起分支的輪廓;熒光表達強度也明顯增強(Fig 3B，D)，說明Ato能上調皮層神經元SYP、PSD-95蛋白表達水平。

Fig 3 Expression of SYP and PSD-95 affected by atorvastatin with immunofluorescence，green shows SYP，red shows PSD-95，blue shows Hoechst 33528 nuclear redyeing

Fig 4 Western blot結果進一步證明了Ato(0.1、1、10 μmol·L－1)作用48 h 可明顯增加 SYP 蛋白表達水平(P＜0.01)，Ato 1 μmol·L－1作用最明顯。應用Ato作用12 h就可使SYP蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，隨著給藥時間延長，其作用進一步增加。

Fig 5 Western blot結果進一步證明了Ato(0.1、1、10 μmol·L－1)作用 48 h 可明顯增加 PSD-95 蛋白表達水平(P＜0.05)，Ato 1 μmol·L－1作用最明顯。應用Ato作用12 h就可使PSD-95蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，隨著給藥時間延長，作用進一步增加，應用Ato作用48 h達到高峰。

Fig 4 Concentration-dependent effect of atorvastatin on synaptophysin(SYP)protein levels in rat cortical neurons by Western blot.B is semiquantitative result of A(±s，n=3)*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.

3 討論

神經元樹突具有接受刺激并將沖動傳入細胞體的功能。樹突表面可見許多棘狀突起，稱樹突棘，是神經元間形成突觸的主要部位。樹突分支的增加可以提供更多的表面進行突觸發生［11］，因此樹突的發育決定了神經元接受到突觸的數目和方式，所以樹突生長出現缺陷的結果是非常嚴重的，常常伴隨著一些神經退行性疾病如AD。因此突起正常的生長和分支對神經系統正常行使功能是很關鍵的。

大量研究顯示在神經元剛分化出樹突和軸突后，突觸蛋白基因表達合成包含突觸前和突觸后蛋白復合物的囊泡，此時當軸突和樹突接觸就形成初步配對的暫時性突觸聯系，最終由突觸活動決定這些突觸會穩定存在還是消失。SYP和PSD-95作為突觸功能的分子標志，分別代表了突觸前和突觸后的可塑性過程，在皮層可塑性中發揮作用。說明突觸蛋白在反應性的突觸發生過程中起重要作用并參與發育神經元的突觸形成。早期研究發現AD患者腦內的突觸蛋白均有降低。Ho等［12］采用重排的方法篩選了人的6 794種候選基因，結果發現synapsin-Ⅱ基因在早期AD患者的皮質中的表達減少，提示synapsin-Ⅱ的表達在AD的早期有一定的調節作用。另有研究表明AD患者腦中殘存的突觸終端，在Aβ聚集的同時伴有PSD-95的減少、突觸后結構的改變［13］，這一改變可能與NMDA受體過度激活所引起的鈣超載有關［14］。

本實驗研究了不同濃度、不同時間條件下，Ato促進皮層神經元樹突生長和SYP、PSD-95蛋白表達，結果表現為Ato劑量依賴性的增加TDBL、PDN?？筛幸饬x的是Ato并未劑量依賴性的增加SYP、PSD-95 表達，反而是當 Ato 1 μmol·L－1時 SYP、PSD-95 表達達高峰，而 Ato 10 μmol·L－1增加 SYP、PSD-95 的效果不及 Ato 1 μmol·L－1，我們考慮為藥物濃度過大可能會對神經元產生抑制作用。就本次研究發現而言，對于直接作用于神經元的化學物質，往往破壞神經元內在平衡機制，當濃度過大時可能會對神經元產生一種不良反應或毒性，其深層機制有待于進一步研究。

Fig 5 Concentration-dependent effect of atorvastatin on PSD-95 levels in rat cortical neurons by Western Blot.B is semiquantitative result of A(±s，n=3).*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

［1］Cully M，You H，Levine A J，et al.Beyond PTEN mutations:the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumor genesis［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(3):184－92.

［2］Staal S P，Hartley J W，Rowe W P.Isolation of transforming marine leukemia viruses from mice with a high incidence of spontaneous lymphoma［J］.Proc Natal Acad Sci USA，1977，74(7):3065－7.

［3］Staal S P.Molecular cloning of the akt oncogene and its human homologues AKT1 and AKT2:amplification of AKT1 in a primary human gastric Aden carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(14):5034－7.

［4］閔 嶸，秦 川，趙志煒，等.APP17肽對APP轉基因小鼠突觸相關蛋白表達的影響［J］.中國藥理學通報，2006，22(6):710－4.

［4］Min R，Qin C，Zhao Z W，et al.Effect of APP17 peptide on the expression of synaptic associated protein in amyloid precursor protein transgenic mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(6):710－4.

［5］Koseoglu S，Lu Z，Kumar C，et al.AKT1，AKT2 and AKT3-dependent cell survival is cell line-specific and knockdown of all three isoforms selectively induces apoptosis in 20 human tumor cell lines［J］.Cancer Biol Ther，2007，6(5):755－62.

［6］Lawlor M A，Alessi D R.PKB/Akt:a key mediator of cell proliferation，survival and insulin responses［J］.J Cell Sci，2001，114(Pt 16):2903－10.

［7］Heitman J，Movva N R，Hall M N.Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast［J］.Science，1991，253(5022):905－9.

［8］Wullschleqer S，Loewith R，Hall M N.TOR signaling in growth and metabolism［J］.Cell，2006，124(3):471－84.

［9］Zhou X，Tan M，Stone Hawthome V，et al.Activation of the Akt/mammalian target of rapamycin/4E-BP1 pathway by ErbB2 over expression predicts tumor progression in breast cancers［J］.Clin Cancer Res，2004，10(20):6779－88.

［10］Debnath J，Walker S J，Brugge J S.Akt activation disrupts mammary acinar architecture and enhances proliferation in an mTOR-dependent manner［J］.J Cell Biol，2003，163(2):315－26.

［11］Stroemer R P，kent T A，Hulsebosch C E.Neocortical neural sprouting.Synaptogensis，and behavioral recovery after neocortical infarction in rats［J］.Stroke，1995，26(11);2135－44.

［12］Ho L，Guo Y，Spielma L，et al.Altered expression of a-type bue not b–type synapsin isoform in the brain of patients at high risk for Alzheimer's disease asscssed by DNA microarray technique［J］.Neurosci Lett，2001，298(3):191－4.

［13］Gylys K H，Fein J A，Yang F，et al.Synaptic changes in Alzheimers disease increased amyloid-beta and gliosis in surviving terminals is accompanied by decreased PSD-95 fluorescence［J］.Am J Pathol，2004，165:1809－17.

［14］Kelly B L，Ferreira A.beta-Amyloid-induced dynamin 1 degradation is mediated by N-methyl-D-aspartate receptors in hippocampus neurons［J］.J Biol Chem，2006，281:28079－89.