羅格列酮對阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征模型血清和脂肪組織抵抗素、瘦素表達的影響

周 燕，湯鳳蓮，蔡姍姍

(桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西桂林 541001)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)可導致心腦血管疾病、內分泌代謝紊亂、脂代謝紊亂、2型糖尿病及胰島素抵抗等相關并發癥，并與肥胖密切相關。肥胖和胰島素抵抗是OSAS主要發病環節之一，脂肪激素在胰島素抵抗以及代謝綜合征組分疾病的發生、發展中起重要作用。瘦素作為一種脂肪激素，是肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗聯系的關鍵所在［1］。抵抗素也是一種由脂肪細胞分泌的新的多肽類激素，由Steppan于2001年在研究抗糖尿病藥物——噻唑烷二酮類時發現并命名。本研究旨在觀察應用羅格列酮對OSAS豬模型進行干預性治療后對實驗動物抵抗素、表達及高胰島素血癥、胰島素抵抗的影響，探討OSAS發病機制，進一步尋找藥物治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇幼年♀清潔陸川豬23只(由桂林醫學院動物實驗中心提供)，月齡10～12周，體質量30～40 kg，

1.1.2 主要實驗試劑 TRIzol RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(大連寶生物公司);TAq酶(北京天根生物公司);Leptin mRNA引物(上海英駿生物公司);兔抗豬Leptin一抗(博士德公司)。

1.1.3 主要實驗儀器 多導睡眠監測儀1臺(美國泰科公司生產);Legendmiro 17R型微量臺式高速冷凍離心機(Thermo公司);Biometra型PCR擴增儀(德國耶拿分析儀器股份公司);JS-780型全自動凝膠成析系統(上海培清科技);酶標儀(Labsystem MK3，芬蘭);EPS 301型SDS-PAGE電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech公司);SD轉膜儀(BIORAD)公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組 陸川豬為自然狀態下的OSAS動物模型，經呼吸睡眠監測其OSAS發生率為50%［2］。用普通飼料由專人喂養。實驗前1周所有動物均做暗適應訓練，靜脈注射安定(0.1 mg·kg－1)，誘導其進入睡眠狀態。采用多導睡眠監測儀進行監測其口鼻氣流、鼾聲、胸腹式呼吸、睡眠呼吸暫停低通氣指數及脈搏血氧飽和度，記錄時間為7 h，開始4 h為側臥位，后3 h為仰臥位。根據監測結果，其中符合OSAS診斷標準的12只作為OSAS模型組，將OSAS模型組隨機分為兩組:OSAS組6只，羅格列酮干預組6只。在不符合OSAS診斷標準的11只中隨機選取6只作為健康對照組。羅格列酮干預組(干預組)喂服羅格列酮0.2 mg·kg－1·d－1;正常對照組(對照組)及 OSAS 模型組(模型組)給予等量生理鹽水，每天1次。各組均連續12周。實驗結束后處死各組實驗動物提取大網膜脂肪組織，分別用DEPC水與無菌冰生理鹽水沖洗并剪成0.5 g大小的脂肪塊，分裝在無菌EP管中密封，迅速液氮冷凍，－80℃保存，DEPC水沖洗過的留做RT-PCR，生理鹽水沖洗過的留做蛋白質免疫印跡分析(Western blot方法)。

1.2.2 血清學指標檢測 所有受試對象均禁食過夜12 h，用20%烏拉坦腹腔內注射麻醉后，抽取耳緣靜脈血5 ml，檢測空腹抵抗素、瘦素、空腹血糖、胰島素、胰島素原，采用HOMA模型公式計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=(胰島素×血糖)/22.5。抵抗素、瘦素采用酶聯免疫分析法(ELISA)，試劑盒購自美國 Phoenix Pharmaceutical公司，血糖采用葡萄糖氧化酶法，胰島素、胰島素原采用放射免疫(RIA)法。

1.2.3 RT-PCR法檢測脂肪組織抵抗素、瘦素mRNA基因的表達

1.2.3.1 提取脂肪組織總RNA 將超低溫凍結的RNA提取樣品迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研棒研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，取研磨成粉末狀的樣品100 mg加入到含有1 ml RNAiso plus的2 ml EP管中，輕搖混勻，置于冰浴上勻漿5 min，反復離心，浴上勻漿 5 min，12 000 r·min－14 ℃離心5 min;加入200 μl氯仿，震蕩混勻，冰浴上靜置 5 min，12 000 r·min－14℃離心 15 min;將上清液移至新的1.5 ml EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇，冰浴上靜置10 min，12 000 r·min－14℃離心10 min;棄上清保留沉淀，加入1 ml 75%乙醇，12 000 r·min－14 ℃離心5 min;棄上清保留沉淀，干燥;溶解于30～50 μl DEPC處理水中。用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。

1.2.3.2 總RNA 逆轉錄成cDNA 各取1 μg RNA按試劑盒操作說明逆轉錄為cDNA。

1.2.3.3 目的基因片段的 PCR擴增 取1 μl cDNA為模板，分別以瘦素的引物(上游引物5'-ACAAAGGCCAGTTTACGGTT-3'，下 游 引 物 5'-ACATCTCCAGGCTTTTATGAGG-3';擴增片段約240 bp);抵抗素的引物(上游引物5'-GTCGCCAGTTTCCTAATTCCTC-3'，下游引物 5'-ACCCAGTGACAGCAAAGCCT-3';擴增片段約112 bp)與內參照β-actin的引物(上游引物5'-CTGCGGCATCCACGACCA-3'，下游引物 5'-TACTCCTGCTTGCTTGCTGATCCAC-3';擴增片段約273 bp)進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μl，擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，72 ℃ 終延伸2 min。最后取擴增產物5 μl在含有0.5 mg·L－1溴己啶的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，產物條帶用凝膠成像系統照相并進行灰度分析。目的片段的相對表達量=目的基因的灰度值/β-actin的灰度值。

1.2.4 蛋白質免疫印跡分析抵抗素、瘦素蛋白含量提取各組脂肪組織總蛋白，用BSA試劑盒測定總蛋白濃度，根據標本蛋白濃度計算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致;行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素濾膜上;將膜用5%的脫脂奶粉封閉后，加入抗抵抗素單克隆抗體、抗瘦素單克隆抗體(稀釋度1∶500)，室溫孵育1 h;洗膜后加入二抗鼠抗兔IgG(稀釋度1∶1 000)室溫孵育1 h;PBST充分洗滌后，用化學發光顯影藥盒顯影，X線膠片曝光記錄影像;凝膠成像分析系統分析膠片，讀取各目的條帶及β-actin的光密度值，計算其比值。

2 結果

2.1 羅格列酮對OSAS模型睡眠監測結果的影響

與模型組比較，干預組 AI、AHI下降，最低SaO2

增加，差異有統計學意義(P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 The influence of rosiglitazone on sleep monitoring results of OSAS model(±s，n=6)

Tab 1 The influence of rosiglitazone on sleep monitoring results of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

Group AI/h AHI/h minSaO2/%Control 2.35 ±0.10 3.13 ±0.20 91.60 ±2.75 Model 29.50 ±10.55＊＊ 34.67 ±15.28＊＊ 75.69 ±8.52＊＊Treatment 12.65 ±7.10＊△ 17.38 ±6.46＊△ 82.37 ±6.89＊△

2.2 羅格列酮對OSAS模型血清抵抗素、瘦素表達的影響 與對照組比較，模型組血清抵抗素、瘦素、血糖、胰島素、胰島素原水平與HOMA-IR均升高，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，干預組上述指標數值下降，但血清抵抗素、瘦素水平仍高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見Tab 2。

2.3 羅格列酮對OSAS模型抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達的影響 RT-PCR的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:正常對照組、模型組和羅格列酮干預組均在240 bp處有特異性的抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達條帶(Fig 1a-b)。與對照組比較，模型組抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達量高于對照組(P＜0.01);與模型組比較，干預組抵抗素mRNA、瘦素mRNA表達量低于模型組(P＜0.05)，但仍高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見Tab 3、Fig 1a－b。

Tab 2The influence of rosiglitazone on serum resistin，leptin of OSAS model(±s，n=6)

Tab 2The influence of rosiglitazone on serum resistin，leptin of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

group Leptin/μg·L －1 Resistin/μg·L －1 Insulin/pmol·L－1 Proinsulin/pmol·L－1Blood sugar/mmol·L－1HOMA-IR Control Model Treatment 12.58 ±5.04 23.64 ±8.49＊＊19.11 ±10.72＊△41.50 ±5.69 54.09 ±5.06＊＊46.53 ±6.43＊△3.70 ±0.51 103.18 ±6.20*4.78 ±0.71△0.37 ±0.64 9.49 ±1.03*0.44 ±0.04△5.33 ±0.71 11.94 ±2.51*7.50 ±0.75△0.88 ±0.13 54.97 ±13.09*1.59 ±0.25△

Tab 3 The influence of rosiglitazone on resistin mRNA、leptin mRNA of OSAS model(±s，n=6)

Tab 3 The influence of rosiglitazone on resistin mRNA、leptin mRNA of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

Group Resistin mRNA Leptin mRNA Control 0.23 ±0.08 0.04 ±0.02 Model 0.54 ±0.03＊＊ 0.16 ±0.02＊＊Treatment 0.37 ±0.01△ 0.10 ±0.01＊△

Fig 1a The difference of groups adipose tissue resistiin mRNA expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment

Fig 1b The difference of groups adipose tissue leptin mRNA expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment

2.4 羅格列酮對OSAS模型抵抗素蛋白、瘦素蛋白表達量的影響 蛋白質免疫印跡分析(Western blot方法)結果顯示:Western印跡發現大約65 ku分子量位置上出現陽性條帶，經掃描發現:與對照組比較，模型組抵抗素、瘦素蛋白表達水平高于對照組(P＜0.01);與模型組比較，干預組抵抗素、瘦素蛋白表達水平低于模型組(P＜0.05)，但仍高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，見Tab 4、Fig 2ab。

Tab 4 The influence of rosiglitazone on resistin、leptin protein expression of OSAS model(±s，n=6)

Tab 4 The influence of rosiglitazone on resistin、leptin protein expression of OSAS model(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs model group

Group Resistin Leptin Control 0.35 ±0.13 0.032 Model 0.68 ±0.12＊＊ 0.172＊＊Treatment 0.51 ±0.07△ 0.109＊＊△

Fig 2a The difference of groups adipose tissue resistiin protein expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment Fig 2b The difference of groups adipose tissue leptin protein expression after 12 weeks of rosiglitazone treatment

3 討論

現已證實OSAS為其他許多疾病的共同病理基礎，具有相當大的潛在危險［3］，與肥胖密切相關。目前對OSAS的病因、發病機制尚不完全清楚，新近研究認為，脂肪細胞因子是導致OSAS發生、發展的重要危險因素［4］。瘦素是攝食調控網絡中的上游因子，通過降低動物食欲、提高能量代謝效率、增加能量消耗、減少脂肪儲存而減輕體質量。瘦素可以從多個途徑參與肥胖調節［5］。抵抗素也是一種由脂肪細胞分泌的新的多肽類激素，其作用是對抗胰島素的效應，使血糖升高，同時刺激脂肪細胞增殖，而導致肥胖。本研究發現，OSAS豬模型血清抵抗素、瘦素水平明顯升高，脂肪組織抵抗素mRNA、瘦素mRNA及蛋白表達灰度值升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。研究發現OSAS患者血清瘦素水平較非OSAS者升高，與體重指數、胰島素抵抗指數呈正相關，且與OSAS患者病情的嚴重程度存在相關性［6］。迄今為止，有兩項小型研究觀察抵抗素和成人OSAS的關系，發現在不同嚴重程度的的患者，抵抗素水平與炎癥水平相關，隨著OSAS嚴重程度的增加抵抗素水平增加，CPAP治療后降低［7］，而本研究則進一步從分子水平、蛋白水平等方面研究脂肪激素與OSAS發生發展的關系。引起OSAS體內抵抗素、瘦素水平升高的機制可能為［8］:OSAS患者睡眠呼吸暫停低通氣指數(AHI)增加，夜間血氧飽和度下降，進而引起交感神經興奮、血管緊張素升高、血壓波動，這些均可導致抵抗素、瘦素水平升高。另外，本研究結果還顯示:與對照組比較，OSAS模型組血糖、胰島素、胰島素原水平、HOMA-IR均升高，差異有統計學意義(P＜0.01);提示OSAS存在高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗等并發癥。

目前藥物治療0SAHS沒有明確的效果。羅格列酮屬噻唑烷二酮類藥物，是有效的核轉錄因子過氧化酶體增殖激活受體γ(PPARγ)的選擇性激動劑。作為一種新型的胰島素增敏劑，羅格列酮具有拮抗胰島素抵抗、降低高血糖、改善脂代謝紊亂、抗動脈粥樣硬化的作用［9］。以往的研究發現［10］，噻唑烷二酮類藥物可通過調節脂聯素、瘦素、腫瘤壞死因子的水平而增強胰島素敏感性，改善IR。本研究結果顯示:與模型組比較，經羅格列酮干預后AI和AHI下降，最低SaO2增加;血清抵抗素、瘦素、抵抗素mRNA表達量、瘦素mRNA表達量、抵抗素蛋白表達水平、瘦素蛋白表達水平、血糖、胰島素、胰島素原、HOMA-IR均降低，差異有統計學意義。這些結果均提示羅格列酮有可能通過減輕胰島素抵抗、下調體內抵抗素、瘦素mRNA及蛋白表達量而改善OSAS模型的代謝及臨床癥狀，降低OSAS并發癥的發生率。從而為開發治療OSAS患者的藥物提供新的靶點，目前國內外均未見此報道，

由于OSAS發病率較高，危害較大，而抵抗素、瘦素與其密切相關，因此，進一步探討OSAS與脂肪激素的內在聯系、羅格列酮有可能通過減輕胰島素抵抗而發揮干預治療OSAS的作用，具有不可忽視的臨床意義。未來抵抗素、瘦素作為研究人類OSAS等代謝紊亂相關疾病的病理生理學標志物將越來越受到關注。

［1］Kershaw E E，Fliter J S.Adipose tissue as an endocrine organ［J］.Clin Endocrinol Metab，2004，89(7):2548－56.

［2］柳廣南，陳學運，張建全，等.一種天然的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征動物模型—陸川豬［J］.中華內科雜志，2004，43(3):224－5.

［2］Liu G N，Chen X Y，Zhang J Q，et al.Lu Chuan pig-one nature animal modify of OSAHS［J］.Chin J Internal Med，2004，43(3):224－5.

［3］Pilla G，Shehadeh N.Abdominal fat and sleep apnea:the chicken or the egg［J］?Diabetes Care，2008，31(suppl 2):303－12.

［4］周 燕，唐 靈，陳梅唏，等.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血清脂肪細胞因子變化及其臨床意義［J］.山東醫藥，2010，50(21):1－3.

［4］Zhou Y，Tang L，Chen M X，et al.Changes of serum adipocy tokines leve ls in patients with obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome and its significance［J］.Shandong Med J，2010，50(21):1－3.

［5］Gonzale Z，Jmenez E，Aguilar C，et al.Leptin:a peptide with therapeutic potential in the obese ［J］.Endocrinol Nutr，2010，57(7):322－7.

［6］王 瑋，孔德磊，康 健，等.阻塞性睡眠呼吸暫停患者瘦素、性激素水平與呼吸調節的關系研究［J］.中國全科醫學，2011，14(4A):1085－7.

［6］Wang W，Kong D L，Kang J，et al.Relation of serum leptin and sex hormone to respiratory control in patients with obstructive sleep apnea［J］.Chin Gener Pract，2011，14(4A):1085－7.

［7］Yamamoto Y，Fujiuchi S，Hiramatsu M，et al.Resistin is closely re-lated to systemic inflammation in obstructive sleep apnea［J］.Respiration，2008，76(4):377－85.

［8］Alawati N，Mulgrew A，Cheema R，et al.Pro-atherogenic cytokine profile of patients with suspected obstructive sleep apnea［J］.Sleep Breath，2009，13(4):391－5.

［9］諸葛銘寧，蔡玉秦，馬淑平.羅格列酮對胰島素抵抗SD大鼠血壓和脂蛋白脂酶的影響［J］.中國糖尿病雜志，2011，19(10):787－9.

［9］Zhu-ge M N，Cai Y Q，Ma S P，et al.The effects of rosiglitazon on lipoprotein lipase and blood pressure in SD rats with insulin resistance［J］.Chin J Diabetes，2011，19(10):787－9.

［10］李慧華，楊 敏，余 敏，等.B3-AR Trp64Arg遺傳多態性對T2DM患者羅格列酮療效的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(3):317－21.

［10］Li H H，Yang M，Yu M，et al.The effect of β-3-AR Tra64Arg on rosiglitazone response in T2DM patients［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):317－21.