替加氟衍生物M1的合成及其體內外抗腫瘤活性研究

秦三海，劉愛芹，于勝海，王風玲

(山東省醫學科學院藥物研究所，山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062)

化療是治療癌癥的重要手段之一，替加氟為常用的一線化療藥物，但其不良反應嚴重，如何使其在發揮抗腫瘤作用的同時，減少毒副作用成為眾多學者關注的焦點。本研究以替加氟為母體，分子中引入1，3，4-噻二唑類雜環和酰氨基團，設計合成新型化合物 M 1，使其抗腫瘤活性疊加，毒性降低，并對其體內外抗腫瘤活性進行了研究，以期為合成高效低毒的抗腫瘤藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、動物、藥品試劑及儀器 人胃癌細胞株HGC27、人肝癌細胞株SMMC7721和人結腸癌細胞株HCT15(購自中國科學院上海生命科學研究所);小鼠肉瘤S180(引自中國醫學科學院藥物研究所);昆明種小鼠(山東魯抗醫藥股份有限公司動物中心);氫氧化鈉(上海華美醫用精細化工廠，分析純);鹽酸(宜昌市銀海化學試劑廠，分析純);甲酸(天津市大茂化學試劑廠，分析純);二氧六環(天津市富宇精細化工有限公司，分析純);氨水、二甲基甲酰胺、硫代氨基脲(國藥集團化學試劑有限公司，化學純)。RPMI 1640(美國Gibco公司);MTT(美國 Sigma公司);紅外光譜儀(Nicolet Nexus 670 FT-IR型傅立葉變換紅外光譜儀，固體KBr壓片);核磁共振波譜儀(Bruker Avance 600、Inova-500);元素分析儀(Perkin-Elmer PE2400);質譜儀(Trap VL);水套式二氧化碳培養箱(美國Forma公司);多標記檢測儀(美國PerkinElmer公司);倒置生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)。

1.2 M1 的合成

1.2.1 1-(四氫-2-呋喃基)-3-乙酸基-5-氟-2，4-嘧啶二酮的制備［1］稱取3-(甲氧基羰基甲基)替加氟6.8 g于250 ml三頸圓底燒瓶中，加35 ml甲醇，加熱使其溶解，滴加10 mol·L－1NaOH溶液，于50℃水浴中反應4 h，減壓蒸除溶劑，加入50 ml蒸餾水及50 ml乙酸乙酯，有機層用50 ml水萃取1次，合并水層，然后用1.2 mol·L－1HCl調pH 4，再用乙酸乙酯萃取(50 ml×2)，合并有機層，加入無水硫酸鈉10 g干燥0.5 h，過濾，蒸除溶劑，得白色固體4.7 g，收率為73.4%。

1.2.2 2-氨基-1，3，4-噻二唑的制備 于 250 ml三頸圓底燒瓶中，加入甲酸2.14 ml和硫代氨基脲3.65 g，攪拌下滴加14.6 mol·L－1磷酸11 ml，在85 ℃水浴中加熱8 h，將反應液傾倒入冰水中，并用濃氨水調至pH 9，析出白色沉淀，減壓抽濾，粗品在水中重結晶，得白色結晶2.8 g，收率為69.3%。

1.2.3 1-(四氫-2-呋喃基)-3-乙酰氨基-(1，3，4-噻二唑-2-基)-5-氟-2，4-嘧啶二酮(M1)的制備 將2.58 g 1-(四氫-2-呋喃基)-3-乙酸基-5-氟-2，4-嘧啶二酮、1.26 g 2-氨基-1，3，4-噻二唑加至500 ml三頸瓶中，加入200 ml二甲基甲酰胺，攪拌使其溶解，置冰浴條件下攪拌降溫，緩慢滴加含2.06 g DCC的二甲基甲酰胺溶液100 ml。在此溫度下攪拌3 h，室溫下繼續攪拌8 h，減壓抽濾。將濾液置于1 000 ml分液漏斗中，加入300 ml乙酸乙酯及300 ml蒸餾水萃取，棄去水層，乙酸乙酯層用20 g無水硫酸鈉干燥0.5 h，過濾，將濾液濃縮至原體積的一半，室溫放置，長形白色針狀DCC聚合物結晶析出后，過濾，濾液放置48 h，析出白色結晶M1，重結晶得純品0.71 g，收率為20.8%。

1.3 抗腫瘤活性試驗

1.3.1 MTT法觀察M1對腫瘤細胞的細胞毒作用 取接種培養24 h的腫瘤細胞，分別加入濃度梯度為100.00、20.00、4.00、0.80 和 0.16 mg·L－1的 M1，同時設空白對照組、陰性對照組、陽性對照組(CDDP)，每組設3個平行孔，藥物作用48 h后，于535 nm處測定各孔吸光度(OD)值，計算平均OD值，采用LOGIT法求IC50值并繪制細胞生長曲線。

1.3.2 M1對小鼠移植瘤S180的實驗治療作用 分別取18～22 g健康小鼠60只，于右側腋窩皮下接種小鼠腫瘤細胞懸液0.2 ml(5×106個)，接種次日按體重隨機分5組，分別為陰性對照組、陽性對照組、M1高、中、低劑量組，陰性對照組鼠數20只，其余各組10只。M1使用時用NS配成含1%DMSO的無菌混懸液，現用現配。高、中、低劑量組給藥劑量分別為 50、25、12.5 mg·kg－1，陽性對照組給藥氟尿苷，給藥劑量為50 mg·kg－1，陰性對照組給予等容積溶媒。腹腔注射給藥，每日1次，給藥體積每只0.5 ml，連續給藥10 d，末次給藥24 h后，處死動物，解剖瘤塊稱重，計算腫瘤生長抑瘤率。

2 結果

2.1 M1結構鑒定 經 IR、MS、元素分析、1HNMR結構表征，合成的化合物與設計的目標化合物結構一致。化合物的IR、MS、元素分析與1HNMR 數據如下:IR(KBr，cm－1):3480(νN-H)，2895(νCH2)，1680(νC=O)，1574(νC=C);ESI-MS(m/z)正離子檢測:341.9［M+H］+，363.9［M+Na］+;元素分析C:42.03%，H:3.57%，F:5.33%，N:20.65%，O:18.91%，S:9.51%(理論值 C:42.23%，H:3.54%，F:5.57% ，N:20.52%，O:18.75%，S:9.39%);1H-NMR(600 MHZ，DMSO-d6)δ，ppm:1.92 ～2.05(3 H，m)，2.24 ～2.30(1 H，m)，3.81 ～3.85(1 H，m)，4.26 ～4.30(1 H，m)，4.71～4.80(2 H，m)，5.95～5.97(1 H，s)，8.08～8.09(1 H，s)，9.20(1 H，s)，12.99(1 H，s)。

2.2 M1對腫瘤細胞的抑制作用 隨著藥物濃度的增加，HGC27、SMMC7721和HCT15等3種人癌細胞株細胞存活率逐漸降低，以100 mg·L－1作用最為明顯，分別為18.21%、22.29%、20.15%，且在0.16-100 mg·L－1濃度范圍內對細胞的抑制作用呈劑量依賴性，但細胞生長抑制率均未超過50%。

2.3 M1對小鼠移植瘤S180的實驗治療作用 化合物M1對荷肉瘤S180小鼠腫瘤生長具有一定的抑制作用，給藥劑量50、25 mg·kg－1對小鼠腫瘤生長抑制率為分別50.28%、46.41%，同時藥物治療組的小鼠生活狀況較好，精神正常、飲食正常、活動自如、皮毛光滑，體重有不同程度增加，在本試驗有效劑量范圍內，無明顯毒性，試驗過程中動物健康、無死亡;陽性對照組小鼠干瘦，精神呈萎靡狀態，飲食欠佳，皮毛稀疏、干燥、粗亂、蓬松，體重明顯降低。見Tab 1。

3 討論

據文獻報道噻二唑類衍生物具有抗細菌、抗病毒、抗驚攣、抗真菌等生物活性［2－3］，多數酰胺類化合物具有藥理活性，又易于與有機體形成氫鍵，也可能改變藥效，化合物M1是以替加氟為母體設計合成的新型化合物，分子中引入1，3，4-噻二唑類雜環和酰氨基團，可使其抗腫瘤活性疊加，毒性降低，生物利用度提高。

Tab 1Therapeutical effect of M1 on S180bearing mice(±s)

Tab 1Therapeutical effect of M1 on S180bearing mice(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the negative group

group Dose/mg·kg－1Tumor weight/g Tumor inhibitory rate/%Negative － 1.81 ±0.77 －Positive 50 0.79 ±0.26＊＊ 56.35 M1 50 0.90 ±0.34＊＊ 50.28 25 0.97 ±0.39＊＊ 46.41 12.5 1.36 ±0.44 24.86

本方法工藝條件溫和，操作簡便。合成中間體時，為了降低成本，加入過量的甲酸;合成目標物時，采用縮合劑DCC及催化劑DMAP，經多次試驗發現DMAP的催化作用并不明顯，最后僅采用DCC。濾液濃縮體積至一半，有助于物質的洗出，因雜質與產物溶解度不同，DCC產生的聚合物首先析出，然后是目標物，最后母液含有其他雜質。避免了柱層析分離的繁瑣及節省了洗脫劑，目標物純度達99%以上。

M1體外對HGC27、SMMC7721和HCT15等3種人癌細胞株細胞具有一定的抑制作用，在0.16～100 mg·L－1濃度范圍內對細胞的抑制作用呈劑量依賴性，但細胞生長抑制率均未超過50%，表明藥物體外無明顯細胞毒作用，但體內抑瘤試驗結果表明藥物50、25 mg·kg－1劑量組對小鼠腫瘤生長抑制率均＞40%，具有體內抑瘤活性［4］，究其原因為M1在體外只是前體化合物，脂溶性高，須在體內轉化為5-Fu而起抗腫瘤作用。

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