去甲腎上腺素對嗎啡依賴大鼠中樞痛覺的調制

石鐵鋒，楊春曉，楊東曉，閆彬彬，許 艷，張 輝，張 穎，徐滿英

(哈爾濱醫科大學1.附屬第二醫院、2.生理學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

阿片類藥物依賴已成當今世界的重要社會問題之一，不僅危害人類的身心健康和家庭幸福，而且還嚴重地干擾了社會安寧和生產發展。嗎啡依賴是一種頑固的、慢性復發性腦病［1］，是多個腦區、多種神經遞質參與的復雜的一系列神經系統適應性改變。動物在嗎啡依賴過程中，腦內腎上腺素能等神經遞質系統發生一定變化，這些變化可能與嗎啡成癮的產生有密切關系。

在大鼠腦內，去甲腎上腺素(NE)是一種重要的神經遞質。NE參與許多腦功能，包括覺醒、注意力、情緒、學習、記憶和應激反應［2］。NE對疼痛的影響是復雜的。NE對疼痛的作用取決于其在中樞神經系統的特異位點，NE能受體亞型的分布，病理性疼痛狀態的持續時間和當時的情況。NE和其他化學物質在下行抑制系統發揮重要的作用。NE可抑制C纖維傳導周圍傷害性刺激信息到脊髓側角［3］。

伏核(NAc)是位于邊緣系統和基底神經節交界處的一個較大的核團。NAc接受大腦不同區域的各種神經纖維的投射，參與調節機體的多種功能，如藥物成癮、行為、學習、運動和心血管活動等。NAc還含有豐富的內源性阿片肽，并在中樞神經系統疼痛傳送和調制中起著重要作用。NAc內的阿片肽和膽囊收縮素相互作用可以調節疼痛。來自中腦導水管周圍灰質(PAG)神經纖維上行投射到NAc和NAc神經纖維下行投射到PAG，它們均參與鎮痛作用。我們研究室已證明［4］，谷氨酸、地卓西平馬來酸鹽和N-甲基-D-天冬氨酸受體參與NAc內傷害性信息傳送的調制。近年來，多項研究已經證實在NAc內存在NE，并表明它在疼痛調節中起著重要作用［5］。但是，NE和酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc內PENs和PINs的痛誘發電活動的影響尚不清楚。因此，本研究使用細胞外的電生理記錄技術，探討NE和酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc內PENs和PINs的痛誘發電活動的影響，以便揭示NE和NAc在嗎啡依賴大鼠中樞痛覺生產和調制的作用。

1 材料和方法

1.1 動物 實驗選用成年、健康Wistar大鼠，清潔級，♀♂不拘，體質量為220～250 g(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物中心提供，級別:Ⅱ，許可證號:黑20020002)。

1.2 方法 大鼠在注射鹽酸嗎啡前，記錄30 min的行為變化。然后，大鼠按逐日遞增劑量的原則，背部皮下注射鹽酸嗎啡，連續給藥6 d，每日藥量依次為:5、10、20、40、50、60 mg·kg－1，3 次 .d－1(8 ∶00，12 ∶00，16 ∶00)，建立嗎啡成癮大鼠的模型［6－7］。

將60只嗎啡依賴大鼠隨機地分為3組:(1)生理鹽水組(20只):NAc內注射生理鹽水0.5 μl;(2)NE 組(20 只):NAc內注射 NE(4 g·L－1，0.5 μl);(3)酚妥拉明組(20只):NAc內注射酚妥拉明(4 g·L－1，0.5 μl);給每種藥的時間均為2 min。d 7 早8∶00觀察大鼠的自然戒斷癥狀后，開始實驗。嗎啡依賴大鼠用200 g·L－1氨基甲酸乙酯(5 ml·kg－1，北京化工廠)腹腔注射麻醉和 50 g·L－1利多卡因必要時創口補充麻醉下實施常規手術，即氣管插管、顱骨開窗、挑開小腦延髓池處的硬腦膜引流腦脊液和分離坐骨神經。術后，將大鼠頭部固定在SN-2腦立體定位儀(Narishige，Japan)上。大鼠腹腔注射溫生理鹽水5 ml補液，熱水袋保暖，維持肛溫37℃ ～38℃。根據 Pellegrino圖譜 B座標系統［8］，對NAc進行定位:A:3.2～4.0 mm;R 或 L:1.0～1.8 mm;H:6.2～7.0 mm。然后進行人工呼吸，并大鼠腹腔注射1 g·L－1氯化筒箭毒堿 (1 ml·kg－1)制動，以松弛肌肉排除肌細胞電活動對本實驗的影響。將帶保護的兩根銀絲刺激電極平行鉤在坐骨神經上，松緊適宜，用液體石蠟浸沒神經。SEN-3301型電子刺激器(Nihon Konden，Japan)發出的串脈沖(延遲:0 ms，間隔:5 ms，強度:5 mA，持續時間:0.3 ms，脈沖:5個)刺激大鼠坐骨神經，作為傷害性痛刺激。關節運動和毛發觸摸被用作非傷害性刺激，以確定疼痛相關的神經元。將內充3 mol·L－1氯化鉀溶液，直流電阻為10～30 MΩ的玻璃微電極固定在SM-21型微電極操縱器(Narishige，Japan)上，并插入NAc內引導痛反應神經元的放電。根據Pellegrino圖譜B座標系統［8］，將內充生理鹽水或NE、酚妥拉明的玻璃微電極固定在SM-11型微電極操縱器(Narishige，Japan)上，并插入NAc(A:3.6 mm;R或L:1.6 mm;H:6.2 mm)內，然后用ZCZ-50型自動抽注儀分別向NAc內勻速注入0.5 μl的生理鹽水或 NE(4 g·L－1，0.5 μl)、酚妥拉明(4 g·L－1，0.5 μl)，給藥時間均為 2 min。觀察注藥前、后痛反應神經元電活動的變化，電信號經JSD-731-F前級放大器(信號的高頻過濾器:3 kHz，低頻率濾波器:0.01 s，放大倍數:100-fold)放大，顯示于VC-9示波器(Nihon Konden，Japan)監視，并用ST-CH707X型雙道磁帶錄音機記錄痛反應神經元的電變化。每個痛反應神經元的放電記錄3次，每2 min 1次，連續觀察30 min。

1.3 神經元的定義 在NAc記錄的神經元分為3種類型:(1)無關神經元:對傷害性刺激或非傷害性刺激均沒有反應;(2)會聚神經元:對傷害性刺激和非傷害性刺激均有反應;(3)痛反應神經元:只對傷害性刺激有反應。痛反應神經元可分為痛興奮神經元(PENs)和痛抑制神經元(PINs)。PENs的定義是指對傷害性刺激增加其放電頻率反應的神經元;而PINs的定義是指對傷害性刺激降低其放電頻率反應的神經元。該研究主要是觀察和記錄PENs和PINs的電活動。

1.4 觀察指標 凈增值(NIV，Hz)，是指 PEN或PIN在傷害性刺激前2 s內放電平均頻率和傷害性刺激后誘發放電平均頻率之間差值。潛伏期(s)是指從傷害性刺激起到出現PEN放電的時間。抑制時程(ID，s)是指從傷害性刺激起到出現PIN放電之間的持續時間。

1.5 統計學方法 實驗結果經Powerlab/8 s(ADInstruments)數據處理儀處理后輸入計算機，用Chart v 5.3軟件(Australian)進行數據分析。所有數據均以±s表示和用SPSS 16.0軟件進行分析。統計差異用重復測量方差分析和F檢驗。兩組間差異顯著性用LSD法。

2 結果

2.1 生理鹽水對嗎啡依賴大鼠NAc痛反應神經元痛誘發電活動的影響 在生理鹽水組，NAc內給予正常生理鹽水，嗎啡依賴大鼠的26 PENs或20 PINs的痛誘發電活動沒有明顯變化(Fig 1a和Fig 2a)。

2.2 NE對嗎啡依賴大鼠NAc痛反應神經元痛誘發電活動的影響 在NE組，24 PENs的平均潛伏期是(0.15±0.03)s，而平均 NIV是(5.53±0.12)Hz。NAc內注射NE后立刻，PENs的潛伏期開始增加，NIV開始下降(Fig 1b)。在給NE后8 min，這些作用達到高峰，即平均潛伏期為(0.69±0.02)s(F=3.174，P＜0.0001)，NIV 為(1.28±0.09)Hz(F=2.458，P＜0.0001)。在給 NE后0～16 min期間，PENs的平均潛伏期(F=60.167，P＜0.0001)和NIV(F=3.681，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 3)。在給NE 20 min后，PENs的潛伏期和NIV開始逐漸恢復。

18 PINs的平均ID是(1.70±0.04)s，而 NIV是(－2.68±0.12)Hz。NAc內注射NE后，PINs的ID開始縮短，并NIV開始增加(Fig 2b)。在給NE后8 min，這些作用達到高峰，即平均 ID下降到(0.44±0.02)s(F=2.904，P＜0.0001)，而 NIV 增加到(－0.21±0.03)Hz(F=66.150，P＜0.0001)。在注射后的4～16 min，平均 ID(F=9.126，P＜0.0001)和NIV(F=1.455，P＜0.0001)出現了明顯變化與生理鹽水組同期相比(Fig 4)。

2.3 酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc痛反應神經元痛誘發電活動的影響 在酚妥拉明組，22PENs的平均潛伏期為(0.16±0.02)s，而NIV為(5.13±0.14)Hz。NAc內給予酚妥拉明后，PENs的潛伏期開始縮短，而NIV開始增加(Fig 1c)。這些效應在給藥后8 min達到高峰，平均潛伏期下降到(0.01±0.03)s(F=138.889，P＜0.0001)，而 NIV 增加到(9.77±0.18)Hz(F=1.432，P＜0.0001)。在給藥后4～12 min期間，PENs的平均潛伏期(F=5.596，P=0.031)和 NIV(F=3.138，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比差異有顯著性(Fig 3)。

Fig 1 Effects of intra-NAc microinjection of normal saline(a)or NE(b)，phentolamine(c)on the evoked discharges of PEN in the NAc of morphine-dependent rats

17 PINs的平均 ID為(1.68±0.05)s，而 NIV為(－2.78±0.09)Hz。在注射酚妥拉明后，ID開始延長，而NIV開始減少(Fig 2c)。在給予酚妥拉明后8 min，PINs的平均ID增加到(4.07±0.02)s(F=2.485，P＜0.0001)，而NIV下降到(－4.80±0.13)Hz(F=3.456，P＜0.0001)。在給藥后0～16 min期間，PINs的平均 ID(F=5.675，P＜0.0001)和NIV(F=1.955，P＜0.0001)分別與生理鹽水組同期相比有明顯差異(Fig 4)。在給予酚妥拉明后20 min，PINs的平均ID和NIV開始恢復。

Fig 3 Influences of intra-NAc microinjection of different substances on the latency(a)and NIV(b)of PENs in the NAc of morphine-dependent rats

3 討論

本研究觀察了NE和酚妥拉明對嗎啡依賴大鼠NAc內PENs和PINs生物電活動的影響。該結果揭示，NAc內給予NE可抑制PENs的電活動，而增強PINs的電活動;而酚妥拉明能增強PENs的電活動和抑制PINs的電活動。可見，酚妥拉明和NE兩者之間在嗎啡依賴大鼠NAc內的作用是對立的。結果表明，NE參與嗎啡依賴大鼠NAc內傷害性信息傳送的調制。此外，PENs和PINs可以被認為是疼痛研究的指標［9］。PENs和PINs對相同的物質具有相反的反應，這也許可以解釋NE和酚妥拉明對疼痛的調制作用。

Fig 4 Influences of intra-NAc microinjection of different substances on the ID(a)and NIV(b)of PINs in the NAc of morphine-dependent rats

NE是一種單胺神經遞質，其對中樞痛覺調節作用相當復雜。我們研究室曾證明，尾核內注射NE可增加嗎啡依賴大鼠尾核內PEN的電活動，降低PIN的電活動，即出現了NE易化疼痛效應［10］。但側腦室注射NE能抑制嗎啡依賴大鼠核束旁的PEN電活動，加強PIN電活動，即表現出NE的鎮痛作用。在本研究中，我們發現NAc內注射NE也能產生鎮痛效果。由于NE廣泛地分布在大腦中。許多腦結構會聚于腦干組成了下行抑制系統，可調節脊髓痛覺的傳遞。NE、5-羥色胺(5-HT)等在下行抑制系統中起著重要的作用。NE能抑制外周C纖維傳送傷害性刺激信息到脊髓側角［3］。NE再攝取抑制劑，從而減輕初期由傷害性刺激引起的疼痛感覺［11］。單胺類，包括 NE、多巴胺(DA)，5 － HT 等，通過不同的神經遞質受體亞型調節背角神經元的興奮性和傷害性疼痛［12］。NE在基礎條件下對痛覺影響不大，但長期疼痛可通過負反饋促進NE介導抑制疼痛［13］。NE和5-HT通過在大腦和脊髓中的下行抑制途徑參與痛覺調制［14］。揭示，NE能系統和痛覺調制系統之間有著密切的關系。

NAc位于尾狀核吻側下方，視神經管頂部。NAc接收來自谷氨酸能、5-HT能和NE能神經元的投射。NAc中含有大量的內源性阿片肽，在控制疼痛的傳送和調制起著重要的作用。NAc可通過阿片肽和膽囊收縮素之間的相互作用來調制疼痛。大量證據表明［15］，DA與NE由額葉前皮質NE能的末稍共同釋放的。NAc的主要神經遞質是DA和NE，研究已證實在NAc內，NE和DA神經遞質的水平是相等的。可見，NAc是中樞痛覺調制系統中重要核團之一。

該系列結果揭示，NAc內給予NE不僅可抑制嗎啡依賴大鼠NAc內PEN的電活動，還能加強PIN的電活動，呈現出NE的鎮痛效應。當NAc內給予α-受體拮抗劑酚妥拉明時，NAc內PEN的電活動加強，而PIN的電活動減弱，表現出酚妥拉明易化疼痛效應。提示，NE或酚妥拉明是通過α-受體介導改變了NAc內PEN和PIN的電活動來調控中樞痛覺的。

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