巴戟天低聚糖對Aβ25-35致擬癡呆模型大鼠學習記憶障礙的影響

陳地靈，張 鵬，林 勵，張鶴鳴，劉頌豪

巴戟天為茜草科植物巴戟天(Morinda Officinalis How.)的干燥肉質根。味甘、辛，性微溫，有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效。主要分布在福建、廣東、廣西、海南等省的熱帶和亞熱帶地區，是我國著名的“四大南藥”之一。巴戟天中主要含有糖類、蒽醌、氨基酸、脂類、有機酸等化合物及無機元素［1］。其中，低聚糖類物質含量高，成分復雜，藥理作用明顯［2－10］，近幾十年來隨著糖類生物學的飛速發展，糖類化合物結構的復雜性和多樣性被闡明，它們所擔負的眾多生物學功能被人們所認識，在藥物化學領域，糖類藥物的研究也愈來愈受重視，被認為是當前藥物發現先導物的重要來源之一。中醫理論認為:腎為先天之本，腎藏精，主骨生髓，上通于腦。人的視、聽、嗅、感覺及思維、記憶等皆出于腦。因此中醫有“從腎論治”的治則來治療癡呆病癥。為闡述補腎藥巴戟天的補腎益腦作用，初步探討巴戟天低聚糖補腎益腦藥效作用及機制，為巴戟天新藥研究與開發提供基礎，同時也為補腎中藥在神經退行性疾病方面的研究提供參考，作者開展了本項研究。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 桌面型數字式雙臂大鼠腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司);JM12001型電子天平(d=0.1 g);BP211D電子天平(d=0.01 mg，Sartorioμs德國);HH-S數顯恒溫水浴鍋;Thermo D-37520型高速冷凍離心機(德國Heraeus公司);Phs-25型pH計(上海精密科學儀器有限公司);庫侖陣列電化學高效液相色譜儀(美國ESA公司:Model 5600A－16通道檢測器，Model 582 solvent Delivery System，Model 542自動進樣器，CoularrayWin工作站)，Dionex Tcc-100型柱溫箱(美國戴安公司);3K超濾管(PALL公司);佳美SK-1快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠)。

1.2 試藥 Aβ25-35(A4559-1 mg，Sigma公司)，聚集態的Aβ25-35形成:取Aβ25-35用無菌生理鹽水配制成2 g·L－1，在37℃保溫箱中放置7 d，使其變為聚集態的Aβ25-35，－20℃保存備用;安理申片(中國衛材藥業);重酒石酸去甲腎上腺素(NE，批號100169-199402);鹽酸多巴胺(DA，批號100070-200405);5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA，批號140737-200501);5-羥色胺鹽酸鹽(5-HT，批號111656-200401);以上四種對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用);乙腈(色譜純，默克公司，批號 1489730-925)，其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 SD大鼠，SPF級，3月齡，84只，雄性，體質量180 g～220 g，飼養環境SPF級，廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物質量合格證號:SCXK(粵)2008-0020，動物使用許可證號:SYXK(粵)2008-0085。

2 方法

2.1 動物分組及造模、給藥方案參考文獻［11］，并根據實際情況做適當修改，SD大鼠適用性飼養3 d后，用30 g·L－1的戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)麻醉后，頭頂部去毛，消毒皮膚并切開，在顱骨上用牙鉆對稱打兩個孔(AP-3.6 mm，ML±2.5 mm，DV3.0 mm)即為海馬區注射點。每側注射5 μl(10 μg)聚集態的Aβ25-35，在5 min內注完，并留針5 min。用骨蠟填補針孔，縫合皮膚并肌肉注射青霉素。假手術組注射等量的生理鹽水，單籠飼養至大鼠完全清醒。手術后d 15分組給藥。

巴戟天低聚糖(OMO，自制，經鑒定其純度＞95%)加蒸餾水配成20 g·L－1，備用。陽性藥安理申(鹽酸多奈哌齊片)研碎用前蒸餾水配置成混懸液 0.125 g·L－1，備用。

Tab 1 The experimental classification and dosage of administration

2.2 行為學檢測 采用水迷宮實驗判斷大鼠學習記憶和認知能力，實驗方法參照文獻［12］，并做適當修改，以定位航行、空間探索為指標，記錄大鼠在120 s內尋找平臺潛伏期及路程，以及大鼠在120 s內在原平臺象限內停留的時間及路程。實驗總共進行5 d，前4 d定位航行實驗，第5 d空間探索實驗。

2.3 OMO對模型大鼠腦組織中單胺類神經遞質的影響 測定方法按課題組前期建立方法［13］進行測定。

2.4 OMO對模型大鼠腦組織病理特征的影響

水迷宮實驗結束后，取大鼠腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，常規石蠟切片，厚度為5 μm，進行蘇木素－尹紅(HE)染色，在2×400高倍顯微鏡下，進行海馬椎體細胞，海馬CA1區、大腦皮質和前腦基底核神經元計數。

2.6 統計學處理 實驗數據用SPSS 16.0統計軟件進行各實驗組間的比較，用Dunnett’s檢驗進行各實驗組與對照組比較。

3 結果與分析

3.1 行為學檢測結果 水迷宮定位航行實驗潛伏期結果顯示，見Tab 2。潛伏期，與空白組比較，模型組顯著延長，差異具有統計學意義(P＜0.01)，而假手術組差異無統計學意義(P＞0.05)。說明造模更具顯著性，手術本身不造成傷害。與模型組比較，給藥組潛伏期明顯縮短并趨于穩定，差異具有統計學意義(P＜0.01)。

Tab 2 Effect of OMO on escape latency ofAβ25－35-treated rats in MWM

水迷宮定位航行實驗總路程結果顯示，見Tab 3。與空白組比較，模型組航行路程延長，差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，給藥組航行總路程縮短，實驗進行到第4 d，差異更具有統計學意義(P＜0.01)。

Tab 3 Effect of OMO on escape latency ofAβ25－35-treated rats in MWM

空間探索實驗，見Tab 4，各組總路程差異沒有顯著性(P＞0.05)，提示各組大鼠在120 s內游泳距離沒有差異，說明實驗對大鼠游泳速度沒有影響?？瞻捉M大鼠在第一象限(即平臺原所在區域)游泳時間(27.36±3.38 s)長于其他象限，且差異具有顯著性，說明大鼠已對平臺形成記憶。與空白組比較，模型組在第一象限游泳時間(20.77±5.63 s)明顯較短，說明 Aβ25－35具有損害大鼠學習記憶功能，OMO高劑量組(31.93±3.39 s)，差異具有統計學意義(P ＜0.01)，提示 OMO 具有改善 Aβ25－35致大鼠記憶功能障礙作用，其余各組差異沒有統計學意義(P＞0.05)。與模型組比較，各給藥組在第一象限游泳時間明顯延長，且差異具有統計學意義(P＜0.01)。

3.2 單胺類神經遞質測定結果 由Tab 5可知，與空白組比較，模型組中5-HIAA和5-HT含量差異具有統計學意義(P＜0.01)，提示 Aβ25－35對大鼠單胺類神經遞質有影響;假手術組差異沒有統計學意義(P＞0.05)，提示手術本身對其無影響。與模型組比較，各給藥組 NE、DA(除安理申 DA含量)、5-HIAA和5-HT含量升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，提示OMO具有促進Aβ25－35擬癡呆大鼠模型腦組織中NE、DA、5-HIAA和5-HT等水平升高的功能。

Tab 4 The results of spatial probe test on rats treated by Aβ25－35

Tab 5 The results of neurotransmitter in brain tissue of Aβ25－35-treated rats

3.3 椎體細胞和神經元計數 實驗結果顯示，結果見Fig 1，與空白組比較(30±2)，模型組(15±3)5個視野的海馬CA1區椎體細胞總數明顯減少，差異具有統計學意義(P＜0.01)，高劑量組(44±4)總數比空白組明顯多(P＜0.01)，其余各組差異無統計學意義(P＞0.05);與模型組比較，各給藥組海馬椎體細胞總數明顯增多，差異具有統計學意義(P＜0.01)。同時與空白組(477±52)比較，模型組(378±60)5個視野的海馬CA1區神經元總數明顯少于空白組，差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，各給藥組神經元總數明顯增多，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

Fig 1 The results of vertebral cells and neurons of hippocampus on Aβ25－35-treated SD rats

Fig 2 The results of vertebral cells and neurons of cerebral cortex and nucleus of Meynert on Aβ25－35-treated SD rats

大腦皮質和前腦基底核神經元計數結果顯示，結果見Fig 2，與空白組比較，模型組神經元計數明顯減少，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，給藥組神經元總數明顯增多，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

4 討論

學習記憶既是認知活動中的重要方面，也是智力結構中的重要要素。學習和認知記憶功能體現了腦的高級整合功能，其功能的減退、甚至喪失是腦衰老的一個重要標志。AD患者的臨床表現為智力減退、近期記憶缺失，以及相關行為能力障礙，所以在AD的診斷和療效評價指標中，學習記憶水平是最重要的因素。Morris水迷宮于20世紀80年代初設計并應用于學習記憶腦機制研究的，其優點是能提供較多的實驗參數，系統全面地考察實驗動物空間認知加工的過程，客觀地反映其認知水平;將實驗動物的學習記憶障礙和感覺、運動缺陷等分離開來，減少它們對學習記憶過程檢測的干擾;操作簡便，數據誤差較小等。本實驗水迷宮實驗結果表明，Aβ25－35模型組定位航行潛伏期明顯長于空白組，定位航行總路程明顯高于空白組，提示 Aβ25－35具有神經毒性，可模擬癡呆長時記憶障礙特征［14］，提示本實驗動物模型造模成功。給予OMO治療后，與模型組比較，大鼠記憶明顯改善，說明OMO具有改善癡呆模型大鼠記憶障礙的作用。

現代研究表明，學習、記憶功能的完善與中樞神經功能的健全密切相關，由于衰老，大腦皮層出現萎縮導致神經興奮性下降、神經遞質合成減少甚至喪失。研究發現，單胺類神經遞質對學習記憶功能起著重要的調節作用。AD的神經化學變化涉及腎上腺素能、多巴胺能、5-羥色胺能等多個神經遞質系統［15］，隨著機體的老化，會出現學習記憶能力的下降，同時腦內單胺類神經遞質的代謝亦發生紊亂，出現NE、DA、5-HT等含量的下降，提示衰老過程中腦內單胺類神經遞質的平衡遭到破壞，并與一些老年性疾如老年癡呆及腦功能的減退有關［16，17］。本研究結果顯示，大鼠雙側海馬區注射Aβ25－35可致大鼠腦內單胺類神經遞質含量降低，給予OMO處理后，其水平恢復到正常，提示OMO改善學習記憶障礙與提高大腦神經遞質水平有關。

近年發現，神經退行性疾病患者的特定神經組織具細胞凋亡的形態學特征，提示細胞凋亡可能參與這些疾病的病變過程［18］。還有人發現過度表達突變型APP的轉基因小鼠的海馬及皮層中有細胞凋亡［19］。這些證據都提示細胞凋亡參與AD的病變過程。本實驗結果顯示，OMO具有抑制大鼠腦組織中海馬CA1區、皮質和前腦基底核神經元細胞的減少，提示其機制可能是抑制神經元凋亡，從而達到抑制腦衰的發展，但其具體生物機制有待進一步深入研究闡述。

本實驗結果在一定程度上說明了補腎要藥巴戟天低聚糖成分具有一定的提高學習記憶能力，與中醫臟象理論“腎主骨，生髓，通腦”相通，提示巴戟天可應于神經退行性疾病的防治，但其作用機制有待進一步深入研究闡明。

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