基于IgY的ELISA用于囊尾蚴循環抗原的檢測

劉 玉，王元倫，唐雨德

囊尾蚴病是我國常見的寄生蟲病，俗稱囊蟲病，其循環抗原(circulating antigen，CA)可以反映囊尾蚴在體內的存活狀況［1］，可以用于囊尾蚴病的診斷與療效考核［2，3］。IgY是特定抗原免疫產蛋母雞后在雞卵黃中形成的多克隆抗體，即卵黃抗體(immunoglobulin Y)。本文應用抗囊尾蚴CA的IgY和酶標記抗CA單克隆抗體1A5組合，建立一種新型雙抗體夾心ELISA檢測囊尾蚴CA，以探討IgY用于囊尾蚴病免疫診斷的可行性，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 血清與抗體 經CT和藥物治療結合確診的囊尾蚴病患者樣品158份(其中血清139份，腦囊尾蚴病患者腦脊液19份)，分別獲自內蒙古通遼囊蟲病醫院、南京腦科醫院、南京軍區總醫院和南京454醫院;經剖檢確診的囊尾蚴病病豬血清222份，采自內蒙古興安盟科右前旗;健康人血清50份，采自南京的健康體檢人員;健康豬血清20份，采自江蘇鎮江某部隊農場;3份弓形蟲病患者血清由濟南軍區軍事醫學研究所提供，8份包蟲病患者血清由新疆軍區防疫隊提供?？鼓椅豺蔆A單克隆抗體1A5由本課題組制備并保存［4］。

1.2 囊尾蚴 CA 由課題組采用親和層析法純化［3］，-20℃保存;弓形蟲與棘球蚴純化抗原分別由濟南軍區軍事醫學研究所與新疆軍區防疫隊贈與。

1.3 抗囊尾蚴CA-IgY的制備與鑒定 取500 μg CA與等體積福氏完全佐劑乳化經翅下靜脈注射25周齡來亨蛋雞10只(首次劑量為500 μg/只，加強劑量為200 μg/只)，每次間隔10 d。首次免疫7 d后開始收集雞蛋。用水稀釋法提取IgY［5-6］，－20℃保存備用。采用紫外吸收法測定純化后IgY的濃度，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析其相對分子量和純度，間接ELISA檢測IgY的活性與特異性。

1.4 血清處理方法 采用IC沸浴法［4］。

1.5 抗囊尾蚴CA單克隆抗體1A5的酶標記 采用簡易過碘酸鈉法［4］標記辣根過氧化物酶(HRP)，HRP為Sigma公司產品。

1.6 IgY-ELISA的方法建立 將IgY按常規包被ELISA反應孔中，洗板后，用100 g/L的脫脂奶粉液(或牛血清清蛋白)37℃封閉2 h，PBS-T液洗滌3次;加入已處理的待測標本100 μl，37℃溫育30～60 min后，PBS-T液洗滌3次;加入稀釋好的HRP-1A5100 μl，37 ℃ 溫育 30 ～60 min，PBS-T 液洗滌 5次，采用TMB顯色方法，測定吸光值(A450)。每板均設陽性對照和陰性對照，以A值＞陰性對照的2.1倍作為陽性判定標準。通過正交試驗來確定最佳檢測條件，設立4個實驗因素，每因素設2個水平，分別為IgY包被濃度、血清溫育時間、酶標抗體濃度和加酶標抗體后溫育時間。

1.7 方法的敏感性與特異性 用已建立的方法檢測囊尾蚴病患者血清、腦脊液、病豬血清以及健康人與健康豬血清以及3份弓形蟲病患者血清、8份包蟲病患者血清并與雙單抗-ELISA［4，7］比較，驗證方法的敏感性、特異性與可行性。

2 結果

2.1 抗囊尾蚴CA-IgY的鑒定 首次免疫后10 d卵黃內檢測到有特異性抗囊尾蚴CA-IgY，加強免疫后效價逐步上升，至30 d，瓊脂擴散效價達1∶128，并維持到55 d。每枚蛋黃經提純后可得到約66.12 mg IgY，經SDS-PAGE分析，純化后的IgY在約65 ku處和25 ku處可見2條清晰的條帶，分別為IgY的重鏈和輕鏈(圖1)。間接ELISA顯示IgY與囊尾蚴CA發生特異反應，ELISA效價大于108，與棘球蚴抗原、弓形蟲抗原反應的ELISA效價小于10。

圖1 lgY純化前后SDS-PAGE分析1:低分子量蛋白標志物;2:純化前IgY;3:純化后lgY

2.2 雙抗體夾心ELISA方法的建立 經正交試驗最終確定的檢測條件為:IgY包被濃度1∶1000、被檢血清溫育時間為60 min;酶標記單抗濃度為1∶800，溫育時間為30 min。

2.3 靈敏度 IgY-ELISA和雙單抗-ELISA檢測囊尾蚴 CA 的靈敏度分別為8.3 μg/L 和13.9 μg/L。

2.4 方法的敏感性與特異性 應用IgY-ELISA和雙單抗-ELISA對450份樣品檢測結果比較，差異無統計學意義(P ＞0.05，表1)。

表1 基于IgY和雙單抗的夾心ELISA檢測結果比較

3 討論

囊尾蚴CA的檢測可作為療效考核指標［2-3］。建立高敏感性和特異性的CA檢測方法是當前囊尾蚴病防治中亟待解決的問題之一?，F有的囊尾蚴CA檢測方法敏感性與特異性還有待提高，其原因可能是因為CA多為囊尾蚴的代謝分泌物，易受到機體免疫系統的清除，從而導致CA在患者血清中含量不高，獨特型抗體的存在也能影響到循環抗原的檢測［8-9］。此外，囊尾蚴CA與棘球蚴抗原存在嚴重的交叉反應［9-10］。應用單克隆抗體作為檢測系統，解決了特異性問題，但敏感性降低，而使用多克隆抗體作為檢測系統，其特異性較差［11］。

本實驗利用IgY的優點［5］，制備出抗囊尾蚴CA的高效價IgY抗體，SDS-PAGE與間接ELISA結果顯示，純化效果較好，可與CA發生特異反應，而與棘球蚴和弓形蟲抗原不發生交叉反應。利用純化的抗囊尾蚴CA-IgY作為捕獲抗體、酶標記單抗1A5為檢測抗體，建立了檢測囊尾蚴CA的夾心ELISA法。其靈敏度為8.3 μg/L，高于雙單抗-ELISA 的13.9 μg/L。從表1可知，IgY-ELISA對139例囊尾蚴患者血清、19例腦囊尾蚴患者腦脊液和222份囊尾蚴病豬血清進行檢測，CA陽性率分別為100.0%、89.5%和100.0%，而雙單抗-ELISA的陽性率分別為97.8%、84.2% 和 100.0%;對 50 份非疫區正常人與20份健康豬的血清檢測，CA陰性率均為100%，而雙單抗-ELISA則分別為98%和100.0%。兩種方法對弓形蟲病患者和包蟲病患者血清檢測，結果均為陰性。經統計學分析，IgY-ELISA與雙單抗-ELISA的敏感性與特異性沒有顯著性差異，但前者的靈敏度似高于后者。

從理論上分析，本文所建立的檢測方法采用多抗與單抗夾心的檢測模式，多抗針對抗原的位點多［12］，用作捕捉抗體可以提高檢測的敏感性;而單抗針對抗原的位點單一，用作檢測抗體則可以提高檢測的特異性［13］。由于雞與哺乳動物種系發生學關系較遠，且IgY制備及純化技術簡單、成熟，卵黃中提取的IgY純度高、含量大，將IgY應用于免疫診斷中，可減少假陽性的出現［14］，從而提高檢測的敏感性與特異性。

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