花椒籽中黑色素提取工藝的優(yōu)化研究

徐文秀，王曉燕，王 鵬

(運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000)

花椒(ZanthoxylumL bungeanum Maxim)別名又叫香椒、大花青椒、山椒，屬被子植物門(Magnoliophydta)雙子葉植物綱(Magnoliopsida)，無(wú)患子目(Sapindales)蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)山花椒種(Zanthoxylum schinifolium)。花椒在我國(guó)有非常悠久的栽培歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)的“八大調(diào)味料”之一。花椒在我國(guó)主要產(chǎn)區(qū)為陜西(韓城)、四川、重慶、山東、山西、河南、河北等地［1］。據(jù)報(bào)道，2009年全國(guó)花椒栽培面積已達(dá)133.3萬(wàn)hm2，年產(chǎn)花椒100萬(wàn)t，花椒籽作為主要副產(chǎn)物，理論上比果皮超出20%左右，因此花椒籽年產(chǎn)約60萬(wàn)t［2］。山西運(yùn)城巿有很多丘陵地區(qū)，這些地區(qū)很適合花椒種植。每年大量花椒上巿后，作為副產(chǎn)物的花椒籽，卻長(zhǎng)期以來(lái)未被充分利用。大量的花椒籽被廉價(jià)收購(gòu)，或當(dāng)作燃料燒掉或撒入田中作為肥料，甚至被當(dāng)作廢物丟棄，造成極大的資源浪費(fèi)。如何利用花椒籽這一資源已迫在眉睫。綜合開發(fā)利用花椒籽既可以解決資源浪費(fèi)、環(huán)境污染的問(wèn)題，還可以帶動(dòng)大批的當(dāng)?shù)亟忿r(nóng)致富。因此，加快花椒籽的研究開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)和長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。研究結(jié)果［3］表明:花椒籽的種皮富含天然黑色素。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，天然黑色素具有抗癌、抑制艾滋病毒復(fù)制、抗蛇毒、治療帕金森癥等功能［4］。因此，黑色素在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。目前，已從黑木耳［5］、黑芝麻［6］、桂花種子皮［7］、黑糯米［8］等天然黑色素食品中提取出黑色素，但有關(guān)花椒籽中黑色素提取和開發(fā)利用的研究報(bào)道還很少。因此，本實(shí)驗(yàn)研究花椒籽中黑色素提取工藝，為花椒籽黑色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒籽 產(chǎn)自山西運(yùn)城夏縣;氫氧化鈉、濃鹽酸、無(wú)水乙醇 均為分析純。

AF1104型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;101A-1E型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠;752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)工藝流程

原料→預(yù)處理→按比例加入提取劑→水浴浸提→過(guò)濾→定容→比色

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先確定提取花椒籽黑色素最佳提取溶劑、提取液最大吸收波長(zhǎng)。然后通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究提取液濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比及提取次數(shù)對(duì)黑色素提取效果的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取對(duì)花椒籽黑色素得率影響明顯的因素:A提取溫度(℃)、B提取時(shí)間(min)、C料液比(g/m L)，根據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理，采用Design Expert軟件程序設(shè)計(jì)3因素3水平的中心組合實(shí)驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 旋轉(zhuǎn)二次正交因素與水平Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑的確定

在提取溫度 20℃、提取時(shí)間 48h、料液比1∶10(g/m L)、提取次數(shù)1次的條件下，用不同的提取溶劑對(duì)花椒籽黑色素進(jìn)行提取。提取結(jié)果如表2所示。確定0.1mol/L NaOH溶液為提取花椒籽黑色素的溶劑。

表2 提取溶劑對(duì)黑色素得率的影響Table 2 Effect of extraction solvent on extraction ofmelanin

2.2 最大吸收波長(zhǎng)確定

在料液比1∶10(g/m L)、提取溫度20℃、提取時(shí)間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溶劑NaOH溶液濃度與最大吸收波長(zhǎng)的關(guān)系。從圖1可以看出:不同濃度提取液，最大吸收波長(zhǎng)基本一致。隨著波長(zhǎng)的增大，吸光度出現(xiàn)了2個(gè)高峰，第1個(gè)峰值出現(xiàn)在波長(zhǎng)250nm處;第2個(gè)峰值出現(xiàn)在波長(zhǎng)550nm處。進(jìn)一步細(xì)化研究條件，得出當(dāng)波長(zhǎng)為212nm、540nm時(shí)，吸光度出現(xiàn)高峰。212nm處吸光值不穩(wěn)，且其吸光值比540nm處值小，結(jié)合相關(guān)資料［9］，本實(shí)驗(yàn)選540 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。

圖1 花椒籽黑色素溶液吸收光譜Fig.1 The absorb curve of themelanin

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 提取溶劑濃度對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶10(g/m L)、提取溫度20℃、提取時(shí)間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溶劑NaOH溶液濃度與吸光度的關(guān)系。由圖2可以看出，隨著NaOH溶液濃度的增加，提取液吸光度先是不斷升高。當(dāng)NaOH溶液濃度達(dá)到0.35mol/L時(shí)，吸光值達(dá)到最高，隨后吸光值會(huì)逐漸下降。這是因?yàn)镹aOH溶液濃度升高有助于花椒籽黑色素的提取，但當(dāng)NaOH濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)提取出更多雜質(zhì)，黑色素也可能與其它物質(zhì)反應(yīng)，使其結(jié)構(gòu)受到破壞。從而導(dǎo)致吸光值降低［10］。

圖2 不同濃度對(duì)黑色素得率的影響Fig.2 Effect of different concentration on the extraction rate ofmelanin

2.3.2 提取溫度對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶10(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取時(shí)間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溫度與吸光度的關(guān)系。由圖3可以看出，提取溫度對(duì)花椒籽黑色素得率有一定的影響，隨著溫度的升高，花椒籽黑色素得率增加，在65℃達(dá)到最大值，但當(dāng)溫度超過(guò)65℃時(shí)，隨著溫度的升高，黑色素得率呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)?植物黑色素是一類由酚類單體組成的大分子物質(zhì)，具有還原性，易氧化，前人研究表明，在氧化過(guò)程中，酚羥基轉(zhuǎn)變?yōu)轷?0℃及以下溫度對(duì)總酚含量的影響無(wú)顯著差異，但在60℃以后，酚類物質(zhì)就會(huì)發(fā)生變化［11］，即黑色素結(jié)構(gòu)被破壞。

圖3 不同溫度對(duì)黑色素得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on the extraction rate ofmelanin

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶10(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取溫度65℃、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取時(shí)間與吸光度的關(guān)系。由圖4可以看出，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花椒籽黑色素得率呈上升趨勢(shì)，在4.5h達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)，這也可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黑色素的分解［6］。而且，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)帶來(lái)其他雜質(zhì)，會(huì)增加后續(xù)精制處理的步驟。

圖4 不同時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響Fig.4 Effect of different time on the extraction rate ofmelanin

2.3.4 料液比對(duì)花籽中黑色素得率的影響 在0.35mol/L NaOH溶液、提取溫度 65℃、提取時(shí)間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究料液比與吸光度的關(guān)系。由圖5可以看出，在一定的料液比范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，花椒籽黑色素的得率呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)榧铀吭酱髣t提取出來(lái)的黑色素就越容易溶解，損失就越少，在1∶30時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后隨著液體比例的繼續(xù)增加，花椒籽黑色素得率不再增加，稍呈下降趨勢(shì)，這是可能因?yàn)殡S著液體比例的增加，會(huì)帶入雜質(zhì)。

圖5 不同料液比對(duì)黑色素得率的影響Fig.5 Effect of different solid to liquid ratio on the extraction rate ofmelanin

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶30(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取溫度65℃、提取時(shí)間4.5h的條件下，研究提取次數(shù)與吸光度的關(guān)系。理論上，黑色素得率應(yīng)該隨著提取次數(shù)的增加而變大，提取次數(shù)越多，提取越充分，直到得率趨于平衡。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:在實(shí)驗(yàn)條件下，提取次數(shù)增加，得率變化不大。一次提取吸光值為0.3957，二次提取吸光值為0.4007，三次提取吸光值為0.4008。說(shuō)明一次提取近乎完全，再增加提取次數(shù)浪費(fèi)原料、溶劑和勞動(dòng)力。因此，綜合考慮，提取次數(shù)確定為1次為宜。

2.4 響應(yīng)面分析結(jié)果與優(yōu)化

以提取溫度A、提取時(shí)間B、料液比C為自變量，以花椒籽黑色素提取液吸光度為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Design Expert軟件程序進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:

各因素的方差分析見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 3 The design and results of Box-Behnken experiments

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table4 ANOVA for response surface quadratics model analysis of variance table

表5 變異系數(shù)分析Table 5 Analysis of CV.%

由表4可以看出:模型“Prob＞F”值小于0.01，表明模型是極顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的;其中A、C、B2、C2對(duì)黑色素提取率影響都極顯著(p＜0.01)，B、A2、AC 的p值(0.01＜p＜0.05)，表明這些因素對(duì)黑色素提取率影響顯著。影響花椒籽黑色素提取率的各因素按影響大小排序依次為溫度(A)＞料液比(C)＞時(shí)間(B)。模型中失擬項(xiàng)p＞0.05，不顯著，說(shuō)明所選模型適宜。同時(shí)，由軟件分析得到的模型的相關(guān)系數(shù) R2為94.63%，變異系數(shù)(C.V%)值為3.29%，說(shuō)明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，可以利用該回歸方程確定最佳條件。

為進(jìn)一步直觀說(shuō)明提取溫度、提取時(shí)間和料液比之間的交互作用和對(duì)提取液吸光度的影響，通過(guò)Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖，進(jìn)行可視化的分析。從3個(gè)三維響應(yīng)面圖(圖6～圖8)可以直觀地觀察到每個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值的影響。

圖6 時(shí)間與溫度對(duì)黑色素得率的響應(yīng)曲面Fig.6 Curved surface of time and temperature to extraction of melanin

圖7 料液比與溫度對(duì)黑色素得率的響應(yīng)曲面Fig.7 Curved surface of temperature and solid to liquid ratio to extraction of melanin

圖8 料液比與時(shí)間對(duì)黑色素得率的響應(yīng)曲面Fig.8 Curved surface of time and solid to liquid ratio to extraction of melanin

由圖6～圖7可知:隨著溫度的增加，黑色素得率也增加，當(dāng)溫度達(dá)到66.32℃時(shí)，黑色素得率達(dá)到最高，隨后會(huì)減小。這可能與過(guò)高溫度會(huì)破壞黑色素結(jié)構(gòu)有關(guān)。由圖6和圖8顯示:隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黑色素得率先增加，當(dāng)時(shí)間超過(guò)4.46h，黑色素得率會(huì)減小，這可能是黑色素長(zhǎng)時(shí)間接觸堿液會(huì)分解，從而導(dǎo)致吸光度降低。圖7～圖8表明:隨著料液比增加，黑色素得率會(huì)下降，這可能與增加提取溶劑，增加了雜質(zhì)的溶出量有關(guān)。

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)花椒籽黑色素提取的最佳工藝為:提取時(shí)間為4.46h、提取溫度為66.32℃、料液比為1∶32.94(g/mL)。在該條件下得到最大的吸光值為0.3083。考慮到實(shí)際操作的可行性，將理論值修正為:提取時(shí)間為 4.5h、提取溫度為 66℃、料液比為1∶33(g/mL)，采用此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得提取液吸光度為0.305，與理論值相差不大，說(shuō)明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)際價(jià)值。

3 結(jié)論

3.1 比較分析了三個(gè)因素對(duì)提取花椒籽中黑色素提取率的影響大小，依次為溫度＞料液比＞時(shí)間。

3.2 花椒籽黑色素提取的最佳工藝，即提取時(shí)間為4.5h、提取溫度為66℃、料液比為1∶33(g/mL)。在該條件下花椒籽黑色素提取液吸光度值為0.305。

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