CDNF治療大鼠脊髓損傷的實驗研究

張 輝 婁永利 閔有會 姜 羽

鄭州大學附屬鄭州市中心醫院神經外科，河南鄭州 450007

脊髓損傷的特點就是致殘率、耗費較高，但是對于其治療方法仍然沒有確切的結論，給社會帶來重大的負擔。目前，隨著神經營養分子（即CDNF）研究的深入，脊髓損傷治療也出現了新的轉機。神經營養分子具有調節神經細胞的生長與發育的功效，是一種促進神經元修復的小分子蛋白。該文選擇了75 至雌性大鼠，研究CDNF 對于大鼠脊髓損傷的治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康的Wista 雌性大鼠75只，其平均體重為268.49g，將上述大鼠隨機分為3組。將其中25只設置為假手術組（A組），25只設定為單純脊椎損傷組（B組），25只設定為采用CDNF 治療脊髓損傷組（C組）。A組大鼠不損傷其脊髓，僅進行脊髓半切損傷模型。B組大鼠注入生理鹽水。對C組大鼠注入10?LCDNF。

1.2 脊髓半切損傷動物模型

稱取上述大鼠的具體重量，使用30 mg/kg 的水合氯醛進行腹腔注射麻醉。靜待大鼠至全麻狀態，使其使大鼠俯臥在手術臺上，并對其四肢進行捆綁固定，剪除手術區的毛發。確定第10 胸椎的位置，對皮膚進行消毒后鋪設一次性手術巾。將大鼠的背部皮膚以及皮下組織切開，使其T8～11處的棘突和椎板更充分的暴露出來。采用持針器把棘突和關節突進行摘除，使脊髓節段暴露更充分。對胸髓一側采取橫向剖開，并把硬模直至中央導水管切斷，使用衛星注射器，對大鼠的脊髓進行2 mm 缺損傷害。在手術后，大鼠的一側肢體會出現痙攣性抽搐并出現癱瘓癥狀，這說明脊髓的版企鵝損傷模型已經制作成功，隨后可以對大鼠進行止血、縫合皮膚等操作。

1.3 術后管理

在手術后使用清潔籠具對大鼠進行單獨喂養，進行青霉素注射，預防大鼠出現感染。同時每天擠壓大鼠的腹部，幫助其進行排便直至膀胱功能恢復。此外，還要定時對大鼠進行翻身，防止其出現褥瘡。在手術后不同時間段內對大鼠進行應用行為學評分。

1.4 免疫組織化學染色與電鏡標本制作

在手術結束后14 d時，對大鼠進行腹腔的麻醉，將其胸部解剖開后以左心房為入口進行置管，若果其右心房有午夜透明液體流出，則即刻使用10%的中性福爾馬林溶液對大鼠進行關注固定。關注30 min后，顯露手術階段，取出2 cm 左右的損傷脊髓，標記后置入10%甲醛溶液進行固定。

在手術后8周，將動物進行腹腔麻醉，剖開胸部后以生理鹽水進行灌注。生理鹽水灌注200 mL后采用40/L 的戊二醛溶液繼續灌注。固定2 h后，取出損傷節段的脊髓組織，固定24 h后，使用環氧樹脂進行包埋后制作超薄切片，電鏡下觀察。

1.5 統計方法

采用SPSS17.0 對收集到的數據進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，進行t 檢驗。

2 結果

2.1 大鼠的應用行為學評分

對手術后的大鼠進行應用行為學評分，發現A組大鼠的評分為滿分，在進行脊髓半切損傷之后大鼠的一側后肢則喪失了運動功能。在手術后1周，B組大鼠也出現側后肢的攣縮，C組患者沒有出現后肢攣縮。在手術后2～4 周時，B組大鼠和C組大鼠均出現不同程度的恢復。在手術后4～8周后，恢復的幅度變小。手術2周后B組和C組大鼠的應用學評分出現明顯差異，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠的應用行為學評分

2.2 3組大鼠的GFAP表達情況

對免疫組織進行化學染色觀察，A組大鼠中GFAP 也出現了GFAP 陽性細胞表達。在脊髓損傷的大鼠脊髓細胞標本中，能夠發現GFAP的表達無規律且明顯增多。C組大鼠的GFAP 陽性細胞低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠的GFAP表達情況對比

2.3 電鏡下脊髓損傷的病理變化

在電鏡觀察下，B組大鼠的神經元細胞核出現碎裂，在脊髓神經纖維髓鞘斷裂分層的部位沒有出現新生的軸突。B組大鼠神經元細胞核也出現碎裂，髓鞘斷裂分層，僅有少量的再生軸突，其細胞質中線粒體數量含量較少。

3 討論

脊髓損傷一般分為2個階段，即原發性和繼發性。脊髓損傷之后，會出現出血性壞死、水腫、炎癥反應、細胞結構的破壞等。在脊髓損傷出現的早期，血管就會出現破壞，脊髓的灰質內的一部分神經元、白質內部的少突出膠質細胞出現壞死。這些壞死的細胞就會釋放出大量的自由基，這些自由基會氧化鄰近的細胞，損傷細胞膜，破壞細胞內的重要結構。在脊髓損傷的過程中，還會出現嚴重的炎性反應。因此而激活損傷處的小神經膠質細胞，該類細胞可吞噬脊髓損傷區壞死的細胞以及碎片。這個過程炎性反應可造成脊髓組織缺血，致使脊髓組織發生壞死，使細胞壞死范圍擴大。

該研究證明，C組大鼠的應用行為學評分明顯高于B組，但是仍然低于A組。C組的GFAP的表達低于B組。C組大鼠的GFAP 陽性細胞低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。CDNF 對于脊髓損傷后反應性星形膠質瘢痕性的形成有明顯的抑制作用，進而能夠促進突觸的連接重建，加速神經功能的恢復。CDNF對于治療脊髓損傷的原理在于，抑制脊髓損傷后星形膠質細胞的增殖和活性，遏制瘢痕的出現，重建神經元的突觸連接。但是，該次試驗也證明，CDNF 治療脊髓損傷的功效仍然有其局限性，若將這一技術與干細胞技術相結合，為脊髓損傷的治療提供更多的參考資料，方可更好的治療脊髓損傷，提高患者的生活質量。

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