毛細(xì)管電泳法測定頭孢羥氨芐膠囊中頭孢羥氨芐的含量

邵 紅

鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450000

頭孢羥氨芐為第一代口服頭孢菌素，臨床上主要用于治療敏感菌所致的尿路感染，呼吸道感染，皮膚軟組織感染和中耳炎等。毛細(xì)管電泳具有操作簡便，分離效率高和易于自動化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于抗生素的分析研究中。有文獻(xiàn)報(bào)道采用近紅外光譜法[1]、分光光度法[2]、導(dǎo)數(shù)光譜法[3]和高效液相色譜法[3-6]測定頭孢羥氨芐，目前尚未見采用毛細(xì)管電泳分析頭孢羥氨芐的報(bào)道。該研究通過對影響毛細(xì)管電泳分離因素的考察，建立測定頭孢羥氨芐膠囊中頭孢羥氨芐含量的毛細(xì)管電泳法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀，二極管陣列檢測器，熔融石英毛細(xì)管柱（50cm×75 m，有效長度37cm），超純水器，BP211D1/10 萬天平,pHS-3C pH 計(jì)。

1.2 試劑

頭孢羥氨芐對照品（純度>95.0%），內(nèi)標(biāo)鹽酸班布特羅對照品（批號200705C01），頭孢羥氨芐膠囊（規(guī)格250 mg/粒）,水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取班布特羅適量，置于100 mL容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為10.0 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取頭孢羥氨芐對照品適量，置于50 mL 容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為10.0 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 樣品溶液的配制 取20 粒頭孢羥氨芐膠囊內(nèi)容物共3 批，精密稱定，研細(xì)，分別稱取3份相當(dāng)于各自平均片重的量置于100 mL 容量瓶中，加水充分溶解后用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 m 濾膜過濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液。

2.2 電泳條件

熔融石英毛細(xì)管柱：50 cm×75 m，有效長度37 cm；運(yùn)行緩沖液：50mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值5.0）；工作電壓：25 kV；電壓進(jìn)樣：10 kV×5 s；柱溫25℃；檢測波長230 nm；毛細(xì)管在每次運(yùn)行前用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液、超純水各沖洗5 min，運(yùn)行緩沖液沖洗10 min，在2次運(yùn)行之間用緩沖液沖洗3 min。

3 結(jié)果

3.1 頭孢羥氨芐對照品及內(nèi)標(biāo)

（A）和樣品中頭孢羥氨芐及內(nèi)標(biāo)（B）的CE 圖,見圖1。

圖1 對照品（A）和樣品（B）的CE 圖

3.2 線性試驗(yàn)

精密量取適量的對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，分別置10 mL 容量瓶中，加水稀釋成含內(nèi)標(biāo)物濃度為0.5mg/mL，對照品濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的溶液。按優(yōu)化后的電泳條件進(jìn)樣，以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，對照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=11.363X-0.0206,r=0.9996。結(jié)果表明，頭孢羥氨芐濃度在0.5～3.0 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗(yàn)

取3.0mg/mL 對照品溶液,按優(yōu)化后的電泳條件重復(fù)進(jìn)樣6次，頭孢羥氨芐對照品與內(nèi)標(biāo)班布特羅峰面積比的RSD 為1.12%，頭孢羥氨芐對照品遷移時間的RSD 為0.89%，班布特羅遷移時間的RSD 為0.93%。

3.4 加樣回收率試驗(yàn)

取20 粒已知含量的頭孢羥氨芐膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取相當(dāng)于頭孢羥氨芐125 mg 的粉末9份,分別精密加入頭孢羥氨芐對照品適量,內(nèi)標(biāo)溶液5.0 mL,置于100 mL 容量瓶中，加水充分溶解后用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 m 濾膜過濾，取續(xù)濾液，按優(yōu)化后的電泳條件進(jìn)樣，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

3.5 樣品測定

精密量取內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL，置于10 mL 容量瓶，加樣品溶液至刻度，按優(yōu)化后的電泳條件進(jìn)樣，按回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

應(yīng)用二極管陣列檢測器對頭孢羥氨芐和內(nèi)標(biāo)班布特羅進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)頭孢羥氨芐和班布特羅在230 nm 和270 nm 處均有較強(qiáng)吸收。在230 nm 處，頭孢羥氨芐和班布特羅吸收較強(qiáng)，峰形較好，且基線穩(wěn)定；在270 nm 處，雖然兩者也有較強(qiáng)的吸收，但峰形相對較差，且基線出現(xiàn)波動。因此，選擇230 nm 為檢測波長。

4.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

內(nèi)標(biāo)的選擇，首先考慮了與頭孢羥氨芐結(jié)構(gòu)相似的氨芐西林，通過改變分離電壓、柱溫、緩沖液的濃度和pH 等實(shí)驗(yàn)條件，不能達(dá)到基線分離。然后選擇班布特羅，通過優(yōu)化分離條件，能夠與頭孢羥氨芐基線分離，且遷移時間與頭孢羥氨芐相近。因此，選擇班布特羅為內(nèi)標(biāo)物。

4.3 分離電壓的選擇

分離電壓越大，藥物的遷移時間越短，但毛細(xì)管中焦耳熱增大，從而使柱效和分離度降低；分離電壓越小，藥物的遷移時間延長，峰形變寬，使分離度降低。分別考察了分離電壓15 kV，20 kV，25 kV，30 kV。結(jié)果顯示，分離電壓為15 kV、20 kV時，兩者雖然能夠分離但遷移時間較長，分離效率較低；分離電壓為30 kV時，遷移時間太短，兩者不能得到很好地分離；分離電壓為25 kV時，兩者能達(dá)到基線分離，峰形較好，且遷移時間適中。因此，選擇25 kV 為分離電壓。

4.4 溫度的選擇

柱溫升高，溶液粘度降低，藥物遷移時間縮短，分離效率提高；但溫度過高，會引起焦耳熱增大，柱效和分離度也隨之降低。分別考察了柱溫15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃。結(jié)果顯示，柱溫為25 ℃時兩者能基線分離，且遷移時間適中。

4.5 緩沖液pH值的影響

緩沖液的pH 是影響毛細(xì)管電泳分離的關(guān)鍵因素。緩沖液pH越高，電滲流也越高，使藥物遷移時間縮短，但過高的pH值會使分離度下降。本文考察了pH值4.0，pH值4.5，pH值5.0，pH值5.5的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液。結(jié)果顯示，選用pH值4.0 和pH值4.5的磷酸鹽緩沖液時，兩者雖然能夠分離，但分析時間較長；選用pH值5.5 的磷酸鹽緩沖液時，分析時間縮短，但兩者不能很好的分離；選用pH值5.0 的磷酸鹽緩沖液時，兩者能達(dá)到基線分離，遷移時間適中，且能獲得良好的峰形。

4.6 緩沖液濃度的影響

緩沖液濃度越高，電滲流越低，使分離度得到提高，同時分析時間延長，但緩沖液的濃度過高，會產(chǎn)生焦耳熱效應(yīng)，使色譜峰展寬，分離度下降。該文考察了30 mmol/L，50mmol/L，70mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值5.0）。選用30 mmol/L 磷酸鹽緩沖液時，兩者不能很好的分離；選用70 mmol/L 磷酸鹽緩沖液時，分析時間變長，色譜峰展寬，分離度下降；選用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液時，頭孢羥氨芐和班布特羅能得到較好分離。因此，選擇50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值5.0）。

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