五子衍宗丸對糖尿病性白內障小鼠晶狀體氧化損傷和多元醇通路的影響*

朱向東，王 燕

(1.甘肅中醫學院中醫基礎理論教研室，甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫學院方劑學教研室，甘肅蘭州730000)

糖尿病性白內障(diabetic cataract，DC)是糖尿病患者致盲的重要原因之一，研究其發病機制，尋找有效的治療方法是眼科學界需要解決的重大課題之一。現代醫學研究［1］認為：DC的發病機制主要包括晶狀體蛋白的非酶糖基化學說、滲透損傷學說和氧化損傷學說。近年來研究認為：晶狀體多元醇通路的異常活躍也是DC發病的重要機制。中醫學認為：肝開竅于目，而肝腎同源，因此，對于老年人因糖尿病引發的白內障宜多從肝腎虧虛論治。五子衍宗丸是治療腎精虧虛引發的不孕、不育癥的經典方，筆者依據中醫異病同治的精神，臨床用于治療DC效果顯著。本實驗研究從氧化損傷和多元醇通路的角度探討五子衍宗丸治療DC的作用機制，以期為五子衍宗丸的進一步運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±1)g，標準飼料喂養，均由甘肅中醫學院科研實驗中心提供。SPF級動物質量合格證號為SCXKC(甘)2004-0006-000020，SPF級實驗設施合格證號為SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2 試劑與儀器

D-半乳糖(C6H12O6)，分子量180，上海生化制劑廠產品，批號20030805。100 g/L D-半乳糖溶液的配制方法：準確稱取D-半乳糖粉末25 g置于燒杯中，用適量的蒸餾水溶解后轉于250 mL容器中，加蒸餾水至刻度，靜置后放入冰箱中貯藏備用。五子衍宗丸，北京同仁堂股份有限公司產品，批號2030142，成人口服，1次6 g，1 d 2次(動物用劑量按體表面積法折算)。氯化鈉注射液，甘肅扶正制藥有限公司產品，批號200010081-1;維生素C片，西安利君精華藥業有限責任公司產品，批號20030604。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20060214)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號 20060217)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20060121)，均由南京建成生物工程研究所提供。JY4001電子天平，上海天平儀器廠產品;UV-9100紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產品;KDC-2044低速冷凍離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司產品;裂隙燈、Dionex 4500 I HPIC/HPIC色譜儀，蘇州醫療器械廠產品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將50只小鼠，隨機分為空白對照組、模型對照組、維生素C組、五子衍宗丸預防組和五子衍宗丸治療組5組，每組10只。造模方法［1］：除空白對照組外，其余4組以左手抓住小鼠，使腹部向上，碘伏消毒后下部，右手將注射針頭于左下腹部刺入，使針頭向前推進 0.5～1.0 cm，再以45°角穿過腹肌固定針頭，緩緩注入100 g/L半乳糖溶液25 mL/(kg·d)。空白對照組以同樣方法腹腔注射相應劑量生理鹽水。1次/d，造模時間20 d。模型對照組、維生素C組、五子衍宗丸治療組造模時不給藥，五子衍宗丸預防組造模同時以五子衍宗丸水煎劑灌胃預防，劑量為1.875 g/(kg·d)(相當于60 kg成人劑量的5倍)，至造模結束。造模結束后，維生素C組以維生素C水溶劑灌胃治療，劑量為0.31 g/(kg·d)(相當于60 kg成人劑量的5倍);五子衍宗丸治療組用五子衍宗丸水煎劑灌胃治療，劑量為1.875 g/(kg·d)(相當于60 kg成人劑量的5倍)，連續20 d。等效劑量按人與動物體型系數折算［2］，受試動物給藥容積均為0.01 mL/g 體質量。

1.4 檢測指標

1.4.1 晶狀體混濁度

除空白對照組外，其余4組在造模結束后檢查晶狀體混濁度，然后斷頭處死模型對照組、五子衍宗丸預防組小鼠，低溫條件下快速摘取晶狀體并采血;空白對照組、維生素C組、五子衍宗丸治療組在治療后檢查晶狀體混濁度，然后處死，摘取晶狀體并采血。

晶狀體混濁度按照以下分級標準，共分5級［2］：Ⅰ級，無混濁(晶狀體透明清亮);Ⅱ級，較混濁(僅赤道部有空泡);Ⅲ級，明顯混濁(空泡擴展到中央);Ⅳ級，核混濁(晶狀體只在中央呈現核性白內障);Ⅴ級，整個晶狀體完全性白內障。

1.4.2 血糖、血清胰島素、糖化血清蛋白指數

各實驗組小鼠于給藥前及給藥20 d分別測定血糖(以微量血血糖監測儀檢測)和血清胰島素(以放免測定法測定)，給藥20 d以NBT還原反應法測定糖化血清蛋白指數。

1.4.3 晶狀體SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量和糖醇含量

取小鼠晶狀體組織以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質量后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中加適量生理鹽水，在玻璃勻漿器內研磨5 min，以3500 r/min離心10 min，取上清液進行下述指標測定：SOD活力測定，采用黃嘌呤氧化酶法;GSH-Px活力測定，以催化還原型谷胱甘肽GSH的反應速度來表示;MDA含量測定，采用硫代巴比妥酸TBA法。另取晶狀體組織以4℃蒸餾水沖洗后，以精密電子天秤稱量質量，低溫(4℃)下勻漿、高速(3000 r/min)低溫離心后，脫蛋白，取上清液用 Dionex 4500 I HPIC/HPIC色譜儀測定晶狀體的葡萄糖、果糖、山梨醇含量。

1.5 統計學方法

將所測數據結果按試劑盒說明書相應公式計算，采用SPSS13.0統計分析軟件處理。晶狀體混濁程度采用Ridit分析法，計量資料數據以均數()±標準差(s)表示，根據方差齊性采用單因素方差分析(One-Way-ANOVN)。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠晶狀體混濁度對比

空白對照組小鼠晶狀體未出現混濁，晶狀體呈透明清亮。隨著半乳糖注射量的積累，在造模結束后，模型對照組小鼠有4只眼睛晶狀體出現輕度混濁，6只高度混濁;維生素C組小鼠有5只眼睛晶狀體輕度混濁，5只高度混濁;五子衍宗丸預防組有6只眼睛晶狀體無混濁，2只輕度混濁，2只高度混濁，保持晶狀體透明百分率達60%;五子衍宗丸治療組有4只眼睛晶狀體輕度混濁，6只高度混濁。在治療后，維生素C組有4只眼睛晶狀體無混濁，5只輕度混濁，1只高度混濁;五子衍宗丸治療組有6只眼睛晶狀體無混濁，4只輕度混濁，未檢查到晶狀體高度混濁的現象。見表1。

表1 各組小鼠晶狀體混濁度對比n=10，±s

表1 各組小鼠晶狀體混濁度對比n=10，±s

注：因小鼠瞳孔小，無法區別Ⅲ級、Ⅳ級與Ⅴ期級，故將3者合為Ⅲ級統計。

組 別 劑量 Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅲ級10 0 0模型對照組 0 0 4 6五子衍宗丸預防組 1.875 g·(kg·d)-1 6 2 2維生素 C 組 0.31 g·(kg·d)-1 4 5 1五子衍宗丸治療組 1.875 g·(kg·d)-1空白對照組0 6 4 0

2.2 各組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數和血清胰島素對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數升高，胰島素水平降低，差別有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，五子衍宗丸治療組、預防組和維生素C治療組小鼠的血糖水平和糖化血清蛋白指數均降低，差別有統計學意義(P＜0.01)。與維生素C組對比，五子衍宗丸治療組兩指標降低更為明顯 (P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數和血清胰島素對比±s

表2 各組小鼠血糖、糖化血清蛋白指數和血清胰島素對比±s

注：與空白對照組對比，＊＊ P＜ 0.01;與模型對照組對比，##P＜ 0.01;與維生素C組對比，△ P＜0.05，△△ P＜ 0.01。

組 別 動物數 血糖/(mmol·L-1) 糖化血紅蛋白指數/10 胰島素/(nmol·L-1)10 4.83 ±1.86 213.3 ±16.23 30.42 ±17.05模型對照組 10 24.86±6.81＊＊ 426.4 ±32.5＊＊ 7.89 ±4.36＊＊維生素 C 組 10 15.68 ±6.12## 335.0 ±32.64## 13.75 ±4.66五子衍宗丸預防組 10 10.15±5.82##△ 271.9±21.11##△ 8.89±7.98△五子衍宗丸治療組 10 7.40±2.63##△△ 218.7±15.32##△△ 20.88±4.26##△△空白對照組

2.3 各組小鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠晶狀體組織SOD、GSH-Px的活力降低，MDA含量升高，差別有統計學意義(P＜0.01、P＜0.05)。與模型對照組對比，五子衍宗丸治療組、預防組小鼠SOD、GSH-Px活力升高、MDA含量降低，差別有統計學意義(P＜0.05 或 P ＜0.01)。見表3。

表3 各組小鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA對比n=10，±s

表3 各組小鼠晶狀體SOD、GSH-Px、MDA對比n=10，±s

注：與空白對照組對比，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與模型對照組對比 ，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 劑量 SOD/(U·mgprot-1) GSH-Px/(U·mgprot-1) MDA/(μmol·gprot-1)60.52 ±15.17 14.30 ±3.31 6.12 ±0.38模型對照組 0 32.26±10.32＊＊ 8.54 ±1.25＊＊ 8.32±0.36*維生素 C 組 0.31 g·(kg·d)-1 49.86 ±24.88## 11.02 ±2.23## 8.03 ±0.25五子衍宗丸預防組 1.875 g·(kg·d)-1 42.56 ±12.36## 10.58 ±4.82## 7.82 ±0.56#五子衍宗丸治療組 1.875 g·(kg·d)-1 50.42 ±17.32## 11.89 ±1.25# 6.72 ±0.58空白對照組0#

2.4 各組小鼠晶狀體組織糖醇含量對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠晶狀體組織中葡萄糖、果糖、山梨醇含量升高 ，差別有統計學意義(P＜0.01)。表明DC小鼠晶狀體組織中存在明顯的葡萄糖、果糖山梨醇蓄積，其多元醇通路異常活躍。與模型對照組對比，五子衍宗丸治療組、預防組小鼠晶狀體組織中葡萄糖、果糖、山梨醇含量降低，差別有統計學意義(P＜0.01);與維生素C組對比，五子衍宗丸治療組降低更為明顯(P＜0.05)。表明五子衍宗丸能有效抑制DC小鼠晶狀體組織多元醇通路的異常活躍。見表4。

表4 各組小鼠晶狀體組織葡萄糖、果糖、山梨醇含量對比 μmol·(g·wet)-1，±s

表4 各組小鼠晶狀體組織葡萄糖、果糖、山梨醇含量對比 μmol·(g·wet)-1，±s

注：與空白對照組對比，＊＊ P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05 ，##P ＜0.01;與維生素 C 組對比，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01。

組動物數 葡萄糖 山梨醇 果糖空白對照組別10 4.08 ±0.73 3.05 ±1.32 1.86 ±0.31模型對照組 10 16.32±4.88＊＊ 31.49±9.76＊＊ 7.91 ±1.63＊＊維生素 C 組 10 11.01 ±3.18## 17.80 ±5.81## 6.07 ±1.48#五子衍宗丸預防組 10 10.86±3.93## 12.56±4.30##△ 3.41±0.91##△五子衍宗丸治療組 10 9.67±2.54##△ 9.42±2.67##△△ 2.73±0.79##△

3 討論

糖尿病性白內障(DC)已成為糖尿病并發癥中僅次于視網膜病變的第二大眼病。我國2型糖尿病患者中白內障發病率高達62.37%，且發病率隨糖尿病病程延長而顯著增加，給糖尿病患者帶來巨大痛苦。已經有研究［1］證實：蛋白質的糖基化在糖尿病性白內障的發生中起著關鍵作用，晶狀體氧化損傷、多元醇通路異常也參與DC的發生發展。DC一旦發生，治療難度大，現代醫學除了手術外，無特效藥物治療。近年來中醫藥防治DC取得了很大進展，尤其是在其發病早期，可通過辨證論治、整體調節而收到較好療效。五子衍宗丸出自《證治準繩》，由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子和車前子5味藥組成，具有補腎益精的作用［3］。筆者臨床運用五子衍宗丸加減治療DC取得了明顯療效，但其作用機制不明。本實驗從氧化損傷和多元醇通路的角度，進一步探討其防治DC的作用機制。

晶狀體的氧化損傷被認為是DC的一個主要激發因素［2］。有研究［2］表明：DC 大鼠晶狀體中的VC、SOD及GSH-Px活性明顯下降，臨床上補充抗氧化劑能有效改善DC;而且氧化損傷的發生與血糖上升有關，血糖水平增高可增加晶狀體中的自由基，因此氧化損傷與晶狀體抗氧化防御系統的紊亂在DC的發生和發展中起著重要作用。SOD和GSH-Px是公認的機體酶促類自由基防御系統，對清除自由基、保護細胞組織起著重要作用。本實驗結果表明：模型對照組小鼠晶狀體中MDA含量比空白對照組明顯增高，而SOD、GSH-Px活性明顯下降，說明DC小鼠晶狀體中酶促類自由基防御系統受到明顯破壞，抗氧化能力明顯降低。五子衍宗丸能顯著提高SOD、GSH-Px活力，減少MDA含量，說明五子衍宗丸具有清除氧自由基，抗氧化損傷，維持晶狀體抗氧化防御系統平衡的作用。

多元醇通路的異常活躍是DC發病的一個重要機制［3-4］。在正常情況下，晶狀體的糖代謝有無氧酵解、有氧酵解、磷酸戊糖旁路和多元醇途徑等4種主要形式。其中，通過無氧酵解將葡萄糖轉化為乳糖是晶狀體糖代謝的最主要形式，提供其所需能量的70%～90%。大約只有5%的葡萄糖經過多元醇通路還原為山梨醇，山梨醇在山梨醇脫氫酶的作用下被氧化成果糖［5］。多元醇通路被激活的原因就是高血糖。當血糖水平明顯升高，葡萄糖通過輔助彌散大量進入晶狀體，醛糖還原酶被激活，從而激活多元醇通路，大量的葡萄糖轉化為山梨醇，進一步轉變為果糖，導致山梨醇、果糖在細胞中堆積，細胞內呈高滲狀態，致使晶狀體水腫，各種營養物質無法進入晶狀體內，氨基酸減少，蛋白質被聚合，晶狀體產生混濁，引起高滲性損害［5］。本實驗結果表明：模型對照組小鼠晶狀體組織中山梨醇、葡萄糖和果糖的含量明顯增加，說明在DC狀態下可能其多元醇通路異常活躍。經五子衍宗丸治療后，DC小鼠晶狀體組織中山梨醇、葡萄糖和果糖的含量明顯下降，說明五子衍宗丸具有抑制DC小鼠晶狀體組織多元醇通路的異常活躍，從而減輕組織細胞的損傷的作用。另外，實驗還觀察到，五子衍宗丸在降低DC小鼠的血糖和糖化血清蛋白指數，以及增加血清胰島素水平方面的作用均明顯優于維生素C組。因此，良好地控制血糖水平可能是五子衍宗丸抑制DC小鼠晶狀體組織多元醇通路異常活躍的一個重要途徑。晶狀體混濁度檢查結果也與上述結果一致，說明：五子衍宗丸可能是通過減輕小鼠的氧化損傷和抑制多元醇通路異常活躍而延緩或者治療DC的，其深層次的作用機制有待進一步研究。

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