實脾飲對糖尿病腎病大鼠的保護作用*

孫紅旭，馬鴻斌，薛國忠，崔慶榮

(1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫學院附屬醫院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅省中醫藥管理局，甘肅 蘭州 730000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重也是最常見的慢性并發癥之一，它引發的終末期腎功能衰竭正在成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。中醫藥在輔助西藥治療該病方面有一定的特色和優勢。實脾飲出自《濟生方》，由附子、干姜、茯苓、白術、木瓜、厚樸、木香、大腹子、草果、甘草、生姜、大棗組成，具有溫陽健脾、行氣利水等功效。本研究選用高糖高脂飼料合并STZ注射，再予以腺嘌呤加寒涼藥的方法建立大鼠 DN 脾腎陽虛型動物模型，觀察其藥效特點。

1 材料與方法

1.1 動 物

雄性SD大鼠(SPF級)70只，體質量200～240 g,由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXF(甘)2011-0021。

1.2 藥品、試劑與儀器

實脾飲，藥材來源于甘肅中醫學院附屬醫院。貝那普利片，上海新亞藥業閔行有限公司產品,批號H20044840。鏈尿佐菌素(STZ)，購自美國Sigma公司，批號100K20090523, 臨用前用預先高壓滅菌的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液 (pH值 4.4) 配成10 g/L的溶液。腺嘌呤,上海新興化工試劑研究所提供，批號061188；內皮素(ET)放射免疫分析藥盒，北京北方生物技術研究所提供，批號110820；一氧化氮(NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號20111111；轉換生長因子β1(TGF-β1)測定試劑盒，上海史瑞克生物科技有限公司提供，批號20110812。GC-911r放射免疫計數器及KDC-2044低速冷凍離心機，均為科大創新股份有限公司中佳分公司產品；UV-2401PC分光光度儀，日本島津產品；B60-32FB3-F01型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；XYJ-80-2型電動離心機，金壇市恒豐儀器廠產品；TG328B型光學讀數分析天平，湘儀天平儀器廠生產；日立7170全自動生化儀，日本HITACH產品；血糖檢測儀，德國拜耳公司產品。

1.3 糖尿病腎病模型的建立

將70只大鼠按體質量編號,以隨機數字表法抽取10只為空白對照組,全程用基礎飼料喂養(總熱量15.335 J/g,碳水化合物熱卡占53%,脂肪熱卡占9%,蛋白質熱卡占20%)；其余60只均以高糖高脂飼料(脂肪 41% ，蛋白 17% ，碳水化合物 42%)喂養4周。第5周將60只大鼠禁食12 h后，按 30 μg/g的劑量腹腔內注射STZ檸檬酸溶液1次，3 d后再同劑量注射1次。末次注射STZ 1周后,用腺嘌呤350 mg/(kg·d)加苦寒中藥煎劑(龍膽草、梔子、番瀉葉)4 mL/(kg·d)混合灌服,連續2周。測血糖、尿糖及尿量。造模大鼠若血糖值高于16.7 mmol/L、尿糖在++以上(含++)、尿量增加多于1倍，出現蛋白尿，大鼠表現出陽虛癥狀者提示造模成功[1-3]。

1.4 分組與給藥

取造模成功大鼠50只，隨機分為模型對照組、貝那普利組[4]及實脾飲高、中、低劑量組共5組，每組10只。各組分別灌胃相應的藥物，大鼠與人之間藥物劑量的換算按照文獻[3]所載公式計算。實脾飲高、中、低劑量組按10 μL/g灌胃實脾飲混懸液，劑量分別為15，7.5，3.75 g/(kg· d)，相當于人用藥量的 10，5，2.5倍；貝那普利組灌胃懸液1×10-3g/kg，模型對照組及空白對照組按10 g/kg 灌胃蒸餾水。共給藥8周。

1.5 檢測指標與方法

①造模后觀察大鼠一般狀態[3]。②于給藥前及給藥后8周檢測空腹血糖。③給藥后第8周末,檢測并記錄體質量，處死前一天收集24 h尿液；脫臼處死所有大鼠，股動脈采血，以3500 r/min離心10 min,分離血清,于-25 ℃冰箱內保存以檢測SCr、ET、NO、TGF-β1含量；迅速取出雙側腎臟，鹽水洗滌，稱量其濕質量。其中大鼠腎臟濕質量用光學讀數分析天平稱量；24 h尿蛋白定量、FBG、SCr用日立7170全自動生化儀測定；ET采用放射免疫法測定，NO采用硝酸還原酶法測定，均按試劑盒說明書進行；血清TGF-β1含量用酶聯免疫吸附法測定，具體操作按ELISA試劑盒說明書進行。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

模型對照組大鼠明顯消瘦，多飲、多尿，精神萎靡，倦怠，蜷縮，反應遲鈍，動作遲緩，毛發無光澤。貝那普利組亦有類似表現，但程度較輕。實脾飲高、中劑量組大鼠體質量增加，精神狀態良好，反應靈敏，動作自如，毛發光澤。實脾飲低劑量組大鼠精神狀況、反應、毛色較高、中劑量組差，但較模型對照組和貝那普利組好。

2.2 各組大鼠體質量、腎指數對比

與模型對照組對比，實脾飲高、中劑量組大鼠體質量明顯增加, 腎指數均降低, 差別均有統計學意義(P<0.05)；貝那普利組及實脾飲低劑量組的大鼠體質量和腎臟指數均無明顯改善(P>0.05)。與貝那普利組對比，實脾飲高、中劑量組腎臟指數降低，差別有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量、腎指數對比 ±s

2.3 各組大鼠FBG對比

與模型對照組對比，實脾飲高、中、低劑量組大鼠FBG下降，差別有統計學意義(P<0.05)；貝那普利組FBG較之差別無統計學意義(P>0.05)。說明貝那普利無明顯降糖效果，見表2。

表2 各組大鼠FBG對比

2.4 各組大鼠SCr對比

與模型對照組對比，實脾飲高、中劑量組大鼠SCr下降，差別有統計學意義(P<0.05)；貝那普利組和實脾飲低劑量組無明顯改善，差別無統計學意義(P>0.05)。說明貝那普利和實脾飲低劑量降低SCr的作用不明顯，見表3。

表3 各組大鼠SCr對比

2.5 各組大鼠24 h尿蛋白定量對比

與模型對照組對比，實脾飲高、中劑量組和貝那普利組大鼠24 h尿蛋白量下降，差別有統計學意義(P<0.05);實脾飲低劑量組無明顯改善，差別無統計學意義(P>0.05)。說明實脾飲高、中劑量及貝那普利均有降低大鼠尿蛋白的作用，而實脾飲低劑量降低大鼠尿蛋白作用不明顯。實脾飲高劑量組24 h尿蛋白量與貝那普利組對比，差別有統計學意義(P<0.05)，說明實脾飲高劑量的療效較佳；實脾飲中劑量組較之，差別無統計學意義(P>0.05)，說明二者療效相當。見表4。

注：與空白對照組對比，* P<0.05；與模型對照組對比，# P<0.05；與貝那普利組對比，△ P<0.05。

2.6 各組大鼠血清NO、ET對比

與模型對照組對比，各治療組NO升高、ET降低，差別有統計學意義(P<0.05)，說明各藥物均有升高大鼠NO、降低ET的功效。實脾飲高、中劑量組NO、ET與貝那普利組對比，差別有統計學意義(P<0.05)，說明實脾飲高、中劑量較貝那普利療效顯著；實脾飲低劑量組與貝那普利組對比，差別無統計學意義(P>0.05)，說明二者療效相當；實脾飲高劑量組與中劑量組對比，差別有統計學意義(P<0.05)，說明實脾飲高劑量療效較佳。見表5。

注：與空白對照組對比，* P<0.05；與模型對照組對比，# P<0.05；與貝那普利組對比，△ P<0.05；與高劑量組對比，＊ P<0.05。

2.7 各組大鼠血清TGF-β1對比

模型對照組大鼠血清TGF-β1含量與空白對照組對比，差別有統計學意義(P<0.01)。各治療組與模型對照組對比，大鼠血清TGF-β1含量在實脾飲高、中劑量組均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，說明治療均有效；實脾飲高劑量組大鼠血清TGF-β1與貝那普利組對比，差別有統計學意義(P<0.01)，提示貝那普利和實脾飲均能降低大鼠血清TGF-β1含量；實脾飲高劑量組降低大鼠血清TGF-β1含量效果更明顯。見表7。

注：與空白對照組對比，** P<0.01；與模型對照組對比，# P<0.05，## P<0.01；與貝那普利組對比，△△ P<0.01。

3 討 論

3.1 選方依據

糖尿病腎病屬中醫學“消渴”范疇。一般認為該病初起多為陰虛燥熱，日久發展為糖尿病腎病，此過程中脾腎陽虛多起著決定性作用，為其基本病機[5]。《太平圣惠方》中提到：“三消者，本起腎虛或食肥美之所發也。腰腎冷者陽氣以衰……故成病矣。”明確指出了消渴病是由于腎虛及飲食不節而引起，腎陽氣虛衰，不能上助脾陽，故而發為本病。實脾飲出自《濟生方》，以附子、干姜為君，附子溫腎陽而助氣化，干姜溫脾陽而助運化，二藥相合，溫腎健脾，溫補脾腎之陽；臣以茯苓、白術滲濕健脾，使水濕從小便而去；佐以木瓜除濕醒脾和中，厚樸、木香、大腹子、草果行氣導滯，氣化則濕化，氣順則脹消，且草果、厚樸兼可燥濕，大腹子兼能利水，甘草、生姜、大棗益脾和中，生姜兼溫散水氣之功，甘草尚能調和諸藥，同為佐使。諸藥相伍，脾腎同治，而以溫脾陽為主；寓行氣于溫利之中，令氣行則濕化。臨床療效亦表明，實脾飲為符合糖尿病腎病病機、治法的有效組方。

3.2 模型評價

高糖高脂飼料加STZ誘導的糖尿病腎病大鼠模型為目前普遍采用的造模方法之一。本實驗為了模仿該病中醫病理特點，在此基礎上選用腺嘌呤加寒涼藥的方法。造模大鼠出現攝食減少，形體消瘦，身體蜷縮，體毛無光澤，反應遲鈍，精神萎靡，體質量下降，血糖升高，大量蛋白尿，腎功能損害等，提示造模成功。

3.3 指標特點

腎小球濾過率(GFR)的檢測一般是要根據其他物質水平的測定來確定，被測物質分為外源性和內源性。其中外源性的測定24 h尿蛋白定量可以準確的評估出GFR水平[6]。內源性物質中，SCr是一種相對較理想的指標，能夠直接、靈敏的反映GFR的程度，特異性較高[7-8]。實驗表明：體內NO和ET應處于一種動態平衡的狀態，以保證血流動力學的穩定。糖尿病腎病初期NO升高，使腎臟入球小動脈擴張，導致腎小球系膜舒張，損傷。接著，ET代償性分泌增多，水平逐漸上升，NO水平逐漸下降，進一步加劇了腎小球硬化的過程[9]。TGF-β1能夠促進細胞增殖、ECM形成和組織纖維化的作用，TGF-β1在DN中介導腎臟纖維化發展的過程[10]。

3.4 結論與展望

本課題研究結果顯示:實脾飲能改善 DN 大鼠的一般狀況，增加體質量，降低腎指數，降低FBG、SCr、24 h尿蛋白定量、ET、TGF-β1含量，升高大鼠血清NO含量，進而減輕腎組織的病理損害，延緩腎小球硬化和腎小管間質纖維化進程，對 DN 有很好的保護作用。但在實脾飲中發揮作用的有效成分及其作用靶點與機制仍不清楚，且并未證明實脾飲高劑量是否是最優劑量，故日后應向方藥作用基礎研究方面努力，包括實脾飲的作用機制、藥理研究、量效關系、配伍效應及藥代動力學等方面的研究。

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