三神散對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制研究

延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是由于腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙臨床綜合征。VD是引起老年性癡呆的第二病因，其研究近年來備受關(guān)注。本研究主要采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制成血管性癡呆大鼠模型，探索三神散對 VD大鼠在學(xué)習(xí)記憶功能的作用及其作用機(jī)制，為 VD的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 三神散(遠(yuǎn)志、石菖蒲、龍骨)購自延吉市中醫(yī)醫(yī)院；喜得鎮(zhèn)片(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H1010054，產(chǎn)品批號：050177)；乙酰膽堿酯酶試劑盒購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮及其記錄分析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司研制)；臺式低溫離心機(jī)(日本SYNYO 公司)；冰凍切片機(jī)(德國)；HM-200型電子天平(日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級大鼠，體重200～250g，雌雄各半，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 動(dòng)物模型制備及分組給藥 采用大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制作VD模型。具體方法如下：10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠背位固定，保證大鼠呼吸暢通。頸前部去毛，碘伏消毒后行頸正中切口l～2cm，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，用l號線將其永久性結(jié)扎。局部消毒后縫合頸部肌肉和皮膚，將大鼠置于保溫臺上，直至清醒。模型組和給藥組行上述手術(shù)處理，假手術(shù)組僅分離而不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。造模后7周手術(shù)組動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、喜得鎮(zhèn)組、三神散低劑量組(10mg/kg)、三神散中劑量組(20mg/kg)和三神散高劑量組(30mg/kg)，共6組，每組7只。術(shù)后8周分別灌胃給予三個(gè)劑量的三神散，3次/周，連續(xù)給藥4周；喜得鎮(zhèn)組按0.6mg/kg灌服，假手術(shù)組、模型組灌胃等量生理鹽水。

1.5 Morris水迷宮測試 灌胃結(jié)束前5天，開始進(jìn)行Morris水迷宮測試。Morris水迷宮主要裝置包括一個(gè)直徑160cm，高60cm的黑色圓柱形水池及一套圖像自動(dòng)采集處理系統(tǒng)。池壁有4個(gè)入水點(diǎn)可將水池均分為4個(gè)象限。在目標(biāo)象限中央放置一個(gè)直徑10cm，高23cm的隱藏平臺。水溫維持在(22±1)℃，水面高于隱藏平臺0.8cm，室溫保持在(24±1)℃。實(shí)驗(yàn)期間水迷宮周圍參照物不變。試驗(yàn)前一天，大鼠在水迷宮中自由游泳5min熟悉環(huán)境。定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4d，每天分上午、下午兩個(gè)時(shí)段分別測試，每只各測試2次。訓(xùn)練時(shí)將大鼠面向池壁從不同象限輕放入水中，同時(shí)記錄其在120s內(nèi)四肢爬上平臺的時(shí)間，即上臺潛伏期(APLP)。

1.6 超氧化物歧化(SOD)、丙二醛(MDA)、Ach含量測定 水迷宮測試結(jié)束后，動(dòng)物麻醉后開胸，用真空采血管(預(yù)先涂有促凝劑)心臟取血，采血針從左心室進(jìn)入取血后離心(3000rpm，10min)，取上清液。利用黃嘌呤氧化法與硫代巴比妥酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。斷頭處死大鼠，于冰臺上取出腦組織，剔除小腦及腦干。冰生理鹽水沖凈表面血跡，濾紙拭干，電子天平稱重。在冰盒內(nèi)使用玻璃勻漿器制備10%的腦組織勻漿，4℃離心(4 000 r/min×10 min)，取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用堿性羥胺法測定乙酰膽堿(Ach)含量。

2 結(jié)果

2.1 三神散對VD大鼠行為學(xué)的影響 定位航行試驗(yàn)中，模型組的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組、三神散高劑量組大鼠APLP明顯縮短，差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.2 三神散對VD大鼠SOD、Ach含量及MDA活性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組SOD、Ach含量明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.05)；與模型組比較，喜得鎮(zhèn)組、三神散高、中、低劑量組SOD、Ach含量明顯升高(P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。

表1 三神散對各組大鼠上臺潛伏期的影響

表2 三神散對VD模型大鼠SOD活性、 MDA及Ach含量的影響

3 討論

血管性癡呆病因較為復(fù)雜，但以缺血性腦血管疾病為最多見，現(xiàn)已證明[1-2]，腦缺血可引起腦組織損傷和功能障礙，影響最明顯的部位是腦前區(qū)和海馬紋狀體區(qū)，其損傷機(jī)制與氧自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒作用、血管活性物質(zhì)的過度釋放、腦內(nèi)乙酰膽堿[3]含量降低等有關(guān)。大量研究表明，這些細(xì)胞內(nèi)外信號的改變可從不同途徑影響學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的通路而引起功能障礙。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)常用于檢驗(yàn)空間學(xué)習(xí)能力和參考記憶。本實(shí)驗(yàn)觀察到，經(jīng)三神散治療后，大鼠 Morris水迷宮逃避潛伏期同模型組相比縮短，差異有顯著性意義(P<0.01)，提示VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶得到改善。三神散主要由龍骨、石菖蒲、遠(yuǎn)志組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍骨[6]鎂離子可參與神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞和神經(jīng)肌肉應(yīng)激性的維持等生理功能活動(dòng)，它可使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末稍乙酰膽堿釋放減少，具有中樞抑制和骨骼肌松弛作用。遠(yuǎn)志[5]水煎可通過提高體內(nèi)抗氧化能力，清除衰老或老化機(jī)體過多生成的自由基，抑制或減輕機(jī)體組織和細(xì)胞的過氧化過程，起到延緩衰老的作用。石菖蒲[4]能增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的耐缺氧能力，抑制腦細(xì)胞凋亡，保護(hù)因缺血、缺氧引起的神經(jīng)功能減退。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明三神散能提高Ach和SOD含量，降低MDA含量，改善學(xué)習(xí)記憶功能。

[1] 王永炎，張伯禮．血管性癡呆現(xiàn)代中醫(yī)臨床與研究[M]．北京: 人民衛(wèi)生出版社，2003: 49.

[2] 周文泉，于向東．關(guān)于血管性癡呆研究的思考[J]．中醫(yī)雜志，2002，43(4)：299-301．

[3] 藺心敬，胡常林，李正國，等．血管性癡呆大鼠模型海馬乙酰膽堿和血小板激活因子含量變化的動(dòng)態(tài)觀察[J]．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2002，19(4)：219-221．

[4] 胡錦官，顧健，王志旺．石菖蒲及其有效成分對學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中藥材，1999。22(11)：584

[5] 陳勤，曹炎貴，張傳惠．遠(yuǎn)志皂苷對淀粉樣肽和鵝膏鈞氨酸引起的膽堿系統(tǒng)功能降低的影響[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(12)：913-917．

[6] 管孝鞠，袁伯俊.中藥促智藥研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，1997，8(1)：55