葒草花提取物體外抗腫瘤活性研究

遼寧中醫藥大學藥學院, 遼寧 大連 116600

葒草花為蓼科植物紅蓼Polygonum orientale L.的花序，具有行氣活血、消積止痛的功效，用于治療頭痛，心胃氣痛，腹中痞積，小兒疳積等癥[1]。現代藥理研究表明，葒草花在抗人結腸癌細胞增殖作用方面效果較好，且紅蓼的果實、莖葉均具有一定的抗腫瘤作用[2、3]。化學成分研究顯示，葒草花的主要成分為黃酮類化合物[4]。黃酮類化合物對于腫瘤細胞的增長繁殖具有顯著的抑制作用[5]。葒草花的抗腫瘤活性部位的篩選和相關實驗研究報道還處于初步探索階段。本文采用了MTT法，對葒草花各不同溶媒萃取物進行了人宮頸癌HeLa細胞、人肝癌SMMC-7721細胞體外活性篩選，為葒草花抗腫瘤的臨床應用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 細胞株 人宮頸癌細胞株HeLa、人肝癌細胞株SMMC-7721由上海復蒙生物有限公司提供。

1.2 藥物與試劑 葒草花采自遼寧省大連市南關嶺，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為葒草Polygonum orientale L. 的花序；胰蛋白酶(Trypsin)、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基噻唑藍(MTT)(美國Sigma公司)；DMEM培養基(美國GIBCO公司)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)；其他試劑皆為分析純；實驗中所用溶液都是由Mili-Q水配制而成。

1.3 主要儀器 CJT-808型超凈臺(沈陽市醫療器械二廠)；酶標儀(瑞士Tecan公司)；NUAIRETM US AUTOFLOW型二氧化碳培養箱(德國NuAir公司)；AE3型細胞倒置相差顯微鏡(德國Motic公司)；96孔培養板(美國Corning公司)；ACCULAB ALC-11C.4型電子分析天平(德國Sartorius Group公司)；Mill-Q型超純水機(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 稱取葒草花100g粉碎至60目，用90%、60%、30%的乙醇分別回流提取三次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑得醇提浸膏。依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取數次，回收溶劑得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取部位。各分部萃取部位制成10mg/ml母液，過0.22μm微孔濾器過濾除菌，放入4 ℃冰箱保存備用。

2.2 細胞培養 將細胞按貼壁細胞培養法接種于含10%滅活胎牛血清的DEME培養液中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

2.3 體外抗腫瘤活性實驗 采用MTT法測定各萃取部位的抗腫瘤活性。選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液后，用含10%小牛血清的DEME培養液調整細胞密度分別為 5×104個/ml，以每孔100μl的細胞懸液接種于96孔培養板中，置于5%CO2及飽和濕度下的培養箱內37℃培養細胞24h。各萃取部位母液用培養基稀釋為50、150、450μg/ml，每組設5個復孔，同時設對照組(對照組加等體積溶劑的培養液)，置于5% CO2及飽和濕度下的培養箱內37℃。繼續培養48h。培養板每孔避光加入50μl MTT，繼續以同樣的條件孵育4h后，棄去上清液，每孔加入l50μl DMSO振蕩混勻，10min后，于酶標儀上492nm波長處檢測各孔的光密度OD值，按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率[6]。

腫瘤細胞生長抑制率(%)

=[1-D(λ)實驗組/D(λ)對照組]×100%

2.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

由表1可知，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對人宮頸癌細胞HeLa和人肝癌細胞SMMC-7721均具有較好的抑制作用。從量效關系上看，當藥物濃度較低(50μg/ml)時，藥物對腫瘤細胞的抑制作用不明顯。隨著用藥濃度的升高，藥物對各細胞的抑制作用均增強，且出現良好的劑量依賴性；在作用濃度為450μg/ml時各萃取部位均具有較好的抑制作用，其中乙酸乙酯部位優于正丁醇部位，且對于SMMC-7721細胞較為敏感，乙酸乙酯部位抑制率在24h 和48h分別為44.47%，59.36%；隨著藥物作用時間的延長，藥物對腫瘤細胞的抑制率也隨之升高。

表1 葒草花不同提取部位對腫瘤細胞的影響 (n=5)

4 討論

4.1 近年來，從中藥中篩選有效抗腫瘤活性成分已逐漸受到人們的重視。文獻報道從葒草花中分離得到了9個化合物，主要為黃酮類[8]，這些成分對于抗腫瘤活性化合物的篩選具有廣闊的開發前景。葒草花為民間及民族常用中藥，具有行氣活血，消積止痛的功效。現代研究表明，葒草花還具有一定的抗腫瘤作用[2]。但有關葒草花的藥理研究文獻極少，尤其是葒草花對人宮頸癌HeLa細胞、人肝癌SMMC-7721細胞的篩選還未見報道。本實驗為葒草花活性部位的篩選提供了參考，為擴大葒草花的應用提供了藥理研究基礎，其藥用機理和體內抗腫瘤實驗有待深入研究和探索。

4.2 實驗通過MTT法篩選了葒草花的乙酸乙酯部位及正丁醇部位在三個不同濃度(50、150、450μg/ml)對腫瘤細胞的體外抑制作用。實驗結果表明葒草花的各萃取部位對人肝癌SMMC-7721細胞比較敏感；乙酸乙酯部位對HeLa細胞和SMMC-7721細胞的抑制率分別為59.36%、74.29%；而正丁醇部位對上述兩種腫瘤細胞的抑制率可達43.33%和69.87%；乙酸乙酯部位的抗腫瘤作用優于正丁醇部位，但兩者均具有不同程度的抗腫瘤活性，對其抗腫瘤活性成分仍有進一步研究的價值。

4.3 從量效關系上看，葒草花的不同萃取部位均對細胞具有增值抑制作用，且腫瘤的抑制率與時間和劑量呈線性關系；隨著給藥劑量的增加，腫瘤抑制率也隨之增強，給藥劑量為450μg/ml時的腫瘤抑制率驟然增高，明顯高于給藥劑量為50μg/ml和150μg/ml。隨著作用時間的增加，對腫瘤細胞的增值抑制作用也隨之增強，48h的抑瘤率明顯高于24h的抑瘤率。

[1] 國家中醫藥管理局中華本草編委會．中華本草(第二冊)[M]．上海：上海科技出版社，1998：681-683．

[2] 宋青，樓一層．紅蓼對腫瘤細胞的作用研究[J]．中國藥師，2009，12(10)：1340-1342．

[3] 翟延君．水紅花子質量標準規范化研究[D]．沈陽：遼寧中醫學院，2005．

[4] 陳秋榮．黃酮類化合物藥理作用的分析[J]．中國實用醫藥，2012，7(21)：254-255．

[5] 李勇軍，何迅，劉志寶，等．葒草花化學成分的研究[J]．中國中藥雜志，2009，34(20)：2613-2614．

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修．藥理實驗方法學(第二版)[M]．北京：人民衛生出版社，2002：1785．

[7] 楊芳，路國華，劉利兵，等．影響MTT比色試驗的關鍵環節[J]．第四軍醫大學學報，2009，30(3)：243.

[8] 李勇軍，何迅，劉志寶，等．葒草花化學成分的研究[J]．中國中藥雜志，2009，34(20)：2613-2614．