TLC-生物自顯影法篩選榆葉合葉子的抗氧化活性

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011

榆葉合葉子(Filipendula ulmaria L.)為薔薇科蚊子草屬多年生草本植物，榆葉合葉子是新疆哈薩克族民間常用藥材，收載于《哈薩克藥志》。榆葉合葉子味微酸澀，性平。具有收斂，降壓等作用，哈薩克族民間應(yīng)于主治高血壓、高血脂引起的頭痛、頭暈、耳鳴[1]，具有悠久的哈薩克醫(yī)臨床用藥歷史和確切的療效。此外榆葉合葉子還具有抗炎、止血、抗?jié)儭⒖鼓⒖鼓[瘤、傷口治療、保肝、抗糖尿病和健腦等作用[2-3]。

TLC-生物自顯影法是一種將薄層色譜分離和生物活性測定相結(jié)合的藥物篩選方法，現(xiàn)主要用于對具有抗菌/真菌,抑制膽堿酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性成分的篩選[4]。榆葉合葉子中主要含有苯酚類、黃酮類和鞣質(zhì)類等成分[5-6]，本文首先建立了榆葉合葉子中黃酮類物質(zhì)的TLC鑒別方法，并采用TLC-生物自顯影法對榆葉合葉子的黃酮類物質(zhì)進行抗氧化活性成分的初步篩選。

1 儀器與材料

半自動點樣儀(CAMAG LINOMAT5)，薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG REPROSTAR3)，100μl微量進樣針，超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1mg)，雙槽展開缸(20cm×20cm)。

金絲桃苷對照品(批號：MUST-11122003)；繡線菊苷對照品(批號：00019345-104)；蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20120226)，槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-2009907)，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基乙醇(2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl，DPPH)(SIGMA)，榆葉合葉子由新疆醫(yī)科大學(xué)帕力達教授采集并鑒定。其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取一定粉碎度的榆葉合葉子花和全草藥材粉末0.5g，用2*50ml甲醇索氏提取法提取，減壓蒸發(fā)干燥，稱重后，殘渣用5ml甲醇溶解配制成供試品溶液備用。

圖1 不同展開系統(tǒng)的榆葉合葉子藥材非揮發(fā)性 成分薄層色譜圖 A. 乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)； B.醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)； C.丙酮-水-甲酸(20∶0.5∶0.5)； 從左至右分別為：花的樣品，全草樣品，混標(biāo)； 混標(biāo)從上至下分別為：槲皮素，繡線菊苷，金絲桃苷，蘆丁

2.2 對照品溶液的制備 分取吸取繡線菊苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素對照品適量，以甲醇制成每1ml含0.5mg的混標(biāo)溶液，作為對照品溶液。

2.3 展開系統(tǒng)的選擇 分別吸取榆葉合葉子花和全草供試品溶液2μl和對照品溶液 2μl，點于同一薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)、醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)、丙酮-水-甲酸(20∶0.5∶0.5)3種不同展開系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以顯色劑，105℃加熱5min至斑點清晰，紫外光366nm下檢視，結(jié)果見圖1。通過圖中斑點數(shù)目、分離度和拖尾情況確定乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)為最佳展開系統(tǒng)。

圖2 不同檢視條件下的榆葉合葉子藥材非揮發(fā)性成分薄層色譜圖 A.可見光下檢視；B.紫外光254nm下檢視； C.紫外光366nm下檢視； 從左至右分別為：花的樣品，全草樣品，混標(biāo)； 混標(biāo)從上至下分別為：槲皮素，繡線菊苷，金絲桃苷，蘆丁

圖3 榆葉合葉子黃酮類物質(zhì)抗氧化活性篩選 從左至右分別為：花的樣品，全草樣品，混標(biāo)； 混標(biāo)從上至下分別為：槲皮素，繡線菊苷，金絲桃苷，蘆丁

2.4 不同檢視方式的考察 分別吸取榆葉合葉子花供試品溶液2μl、榆葉合葉子全草供試品溶液2μl和對照品溶液2μl，點于同一薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，噴以顯色劑，105℃加熱5min至斑點清晰，分別在可見、紫外光254nm和紫外光366nm下檢視，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,榆葉合葉子藥材薄層色譜圖中金絲桃苷、繡線菊苷、蘆丁和槲皮素在3種檢視條件下均斑點清晰，但在紫外光366nm下檢視效果更佳，表明此鑒別方法重復(fù)性好。

2.5 TLC-生物自顯影法 分別吸取榆葉合葉子花供試品溶液、全草供試品溶液和對照品溶液 2μl，點于同一薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，噴以 0. 1% 1,1-二苯基-2-苦肼基自由基乙醇(2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl，DPPH)無水乙醇溶液顯色，105℃加熱5min至斑點清晰，105℃加熱5min至斑點清晰，可見光下檢視。結(jié)果見圖3。薄層板呈紫色背景黃色斑點，說明榆葉合葉子中黃酮類物質(zhì)有抗氧化活性。

3 討論

本研究首先建立了榆葉合葉子黃酮類物質(zhì)的TLC方法，并將TLC-薄層生物自顯影法引入到對榆葉合葉子的抗氧化活性研究中，初步篩選出榆葉合葉子的黃酮類成分具有抗氧化活性，從篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)榆葉合葉子中的繡線菊苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素都具有抗氧化活性，由展開斑點可初步推斷，四種成分的抗氧化能力為槲皮素>蘆丁>金絲桃苷>繡線菊苷，但進一步的確定還需要進行定量分析，另外由篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)榆葉合葉子樣品的TLC-生物自顯影法薄層板上樣品的斑點成條帶狀，說明榆葉合葉子中含有豐富的抗氧化活性成分，且其花的抗氧化活性強于全草的，但是由于榆葉合葉子中的黃酮類成分較多，采用普通有機展開系統(tǒng)進行分離可以進行較好的薄層鑒別，但是用于TLC-生物自顯影法時，不能較好的分離顯示斑點，如何更好的運用TLC-生物自顯影法將樣品中的各黃酮類成分分離的更加清晰是接下來研究的重點。

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