EdU標記渦蟲體內多能干細胞neoblast的方法

劉殿辰, 王玲燕， 趙博生

(1.山東理工大學 生命科學學院， 山東 淄博 255091； 2.山東大成農化有限公司， 山東 淄博 255009)

渦蟲具有強大的再生能力，除咽部和最前端的頭部外，任何大于104個細胞的片段都能再生為一個完整的個體[1-2]；另外由于其分布廣、取材方便，渦蟲已經成為研究發育和再生的模式動物[3].渦蟲強大的再生能力是基于體內存在大量的多功能干細胞(neoblasts).Neoblasts是1892年Randolph在研究成熟渦蟲(Schmidteamediterranea)時發現的類似于胚胎細胞的未分化小細胞[4]，是渦蟲體內唯一有多功能分化活性的細胞[5]，直徑為5～10μm，均勻分散于表皮和肌肉下的實質組織中.2005年Orii等利用抗血清對neoblasts進行了十分清晰的定位，發現neoblasts在背腹間質中呈分散分布，在背部間質中沿中線和兩側線成簇分布[6].

渦蟲在再生過程中，在實質組織中，一定數量的neoblasts接受上皮組織的應激信號，開始增殖，其后代細胞遷移，并產生胚基；2000年 Newmark和 Alvarado通過喂食渦蟲5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, BrdU)，在渦蟲中成功運用BrdU摻入實驗[5]，不僅可以檢測增殖的干細胞，又可以追蹤干細胞分化后的命運，這為后人研究渦蟲的再生提供了很好的分子標記工具.然而，由于雙鏈DNA互補配對的堿基會阻礙抗體和BrdU亞基的結合，從而影響了neoblasts的標記效率.為了暴露出BrdU的抗原決定簇，渦蟲標本必須經過強烈的變性，比如濃鹽酸或乙酸和甲醇的混合液處理.這些強烈的化學處理總會破壞標本的原來結構，從而使得BrdU染色的敏感程度和效果取決于樣品處理的條件[7].

EdU(5-Ethynyl -2′-deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復制的DNA分子中，與BrdU檢測方法相比，EdU檢測方法更快速、更靈敏、更準確.而且EdU染料的分子量只有BrdU抗體的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性(酸解、熱解、酶解等)，可有效避免樣品損傷.本研究基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性的機制，旨在探索EdU能否標記渦蟲體內的neoblasts，為渦蟲再生機制研究和成體干細胞提供新的分子標記物.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 東亞三角渦蟲

東亞三角渦蟲(Dugesiajaponica)采集于山東省博山泉河頭，并飼養于滅菌并充氧過夜的涼開水中，每周喂食豬肝一次，試驗用渦蟲一周前停止喂食.

1.1.2 儀器

德國Leica公司生產的激光共聚焦掃描顯微鏡，日本尼康公司生產的顯微操作系統，上海天平儀器廠生產的電子分析天平FA1004，上海醫療器械五廠生產的電熱恒溫水浴鍋HHS，江蘇金壇國勝儀器廠生產的石英自動雙重純水蒸餾器1810-B等.

1.1.3 試劑

EdU試劑盒購自于廣州市銳博生物科技有限公司，其它試劑均為國產分析純.

1.2 方法

1.2.1 渦蟲的選取及注射

選取大小適中(長約5 mm)的渦蟲約30條，將選好的渦蟲置于冰上冷凍麻醉.將EdU試劑盒中的試劑A用PBS溶解，稀釋濃度為0.5 mg/mL.將冷凍麻醉好的渦蟲置于顯微注射系統下注射，每條渦蟲注射0.6μL.然后將注射好的渦蟲輕輕地轉移到干凈的培養皿中培養12 h.

1.2.2 渦蟲的固定

將注射后培養12 h的渦蟲切割為頭、中部和尾部，頭端沿眼點后緣切割，尾端沿咽部后緣切割，將切割好的渦蟲中部轉移至培養皿中繼續培養，然后分別于3 h、6 h和12 h取出10條用2%的鹽酸殺死并用多聚甲醛固定2 h.

1.2.3 染色

用PBS清洗渦蟲3次，每次10 min，加入100μL滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10min，PBS清洗2次..根據EdU產品說明書配制1×Apollo染色反應液(現用現配)，加入100μL染色反應液避光、室溫孵育30min，棄染色反應液，加入滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)清洗3次，每次10 min，加入甲醇清洗2次，每次5 min，棄甲醇，PBS清洗.

1.2.4激光共聚焦掃描顯微鏡觀察拍照

選用波長550 nm的激光激發Apollo染料，掃描拍照，并用Leica TCS圖像分析軟件對照片進行數據分析.

2 結果與分析

2.1 細胞形態與分布的觀察

激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示：EdU陽性細胞個體較小，呈球形或近球形，除頭部前端和尾部末端未見分布外，主要分布在頭部后端、中部和尾部前端，而且呈現在背腹間質中呈分散分布，背部間質中沿中線和兩側線成簇分布(圖1).EdU陽性細胞特點和分布結果與Orii等[6]用BrdU標記的neoblasts的研究結果完全吻合，因此，可以確定EdU已對neoblasts成功標記.

圖1 Edu標記的neoblasts在再生12h渦蟲體內的分布圖

2.2 渦蟲再生初期neoblasts數量變化分析

為了確定渦蟲再生初期neoblasts的數量變化和EdU的標記效果，分別對再生3 h、6 h和12 h的渦蟲中部EdU陽性信號熒光相對強度進行采集，并進行數據統計分析，結果表明：在渦蟲再生的初期，隨著neoblasts的分裂和數量的增多，熒光相對強度逐漸增強，再生12 h達到最大值(圖2)，這與neoblasts在再生過程中的細胞行為和細胞狀態相一致.

圖2 渦蟲中部再生3h、6h、12h體內neoblasts數量變化圖譜

3 討論

渦蟲具有驚人的再生能力，即使是小到蟲體1/279的渦蟲組織仍然能夠再生出一個完整個體，其再生過程依賴于體內neoblasts的分裂、遷移和分化.neoblasts是渦蟲成體內唯一具有增殖能力和自我更新能力的體細胞，也是體內唯一能分化為神經細胞、生殖細胞等近40種細胞類型的原始細胞[6-8]，因此，探索渦蟲再生過程中neoblasts快速有效的標記方法，已經成為再生機制研究的基礎.

目前常用的neoblasts標記物BrdU，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，可在細胞分裂的S期代替胸腺嘧啶核苷摻入到正在復制的DNA分子中去，再利用抗BrdU的抗體通過免疫組織化學染色顯示增值的細胞.但是由于BrdU在染色上存在的缺陷，標記渦蟲體內neoblasts時，需要對樣本進行強烈的化學處理，從而影響了敏感程度和標記效果[7]，并且，BrdU標記步驟繁瑣，需要通過抗原-抗體反應才能顯現標記效果.EdU(5-Ethynyl -2′-deoxyuridine)作為另一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖時期能夠代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復制的DNA分子中，與BrdU檢測方法相比，EdU的熒光染料Apollo的分子只有BrdU抗體的1/500，在組織和細胞內更容易擴散，檢測方法更快速、更靈敏、更準確，而且無需進行化學處理，可有效避免樣品損傷，因此，基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測渦蟲體內neoblasts是一種可行有效的方法.

本實驗室通過注射EdU對再生渦蟲體內的neoblasts進行標記，結果表明，EdU不僅能夠對neoblasts成功標記，而且比傳統標記物BrdU更快速、更靈敏、更準確.另外，通過對渦蟲中部再生3 h、6 h和12 h的EdU陽性信號的熒光相對強度分別進行統計分析，結果表明，隨著渦蟲再生過程的進行，熒光相對強度逐漸增強，從而說明neoblasts的數量正在增加，這與再生過程中neoblasts的細胞動力學特征相一致.研究結果為渦蟲再生過程中neoblasts的標記提供了又一個分子標記工具，為渦蟲再生的機制研究奠定了基礎.

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[6] Orii H, Sakurai T, Watanabe K. Distribution of the stem cells (neoblasts) in the planarian Dugesia japonica[J]. Dev Genes Evol, 2005, 215 (3) : 143-157.

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[8]Newmark P A，Saha S，Juste R，etal．Planarian regeneration：revisiting a classic problem using modelmethodologies[J]．Developmental Biology，2000，222(1)：231．