牛黃清感膠囊對甲型H3N2流感病毒抑制和預防作用的實驗研究

常 洋 周有財 段書敏 宮君相

1.黑龍江澳利達奈德制藥有限公司，黑龍江哈爾濱 150001；2.黑龍江澳利達醫藥集團，黑龍江哈爾濱 150001；3.中國疾病預防與控制中心病毒病預防控制所，北京 100052；4.黑龍江省澳利達藥業股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150001

甲流病毒是A型流感病毒，防治措施主要針對傳播途徑采取物理、行為預防及發病后對癥治療[1]。目前，抗病毒西藥的種類較多，但對甲流病毒尚缺乏特效藥物，在我國中醫藥已被納入甲流的防治體系。該研究主要是檢測牛黃清感膠囊對甲型H3N2流感病毒的預防作用。

1 實驗材料

1.1 藥物

1.1.1 驗證藥物 牛黃清感膠囊：國藥準字Z20026054，每粒含0.3g生藥，批號090962，生產日期：2009年12月2日，由黑龍江澳利達奈德制藥有限公司提供。

1.1.2 陽性藥物對照 利巴韋林注射液（病毒唑），0.1g/支，蘇衛藥準字（1988）第347003號：批號000223，蘇州第六制藥廠生產。

1.1.3 細胞 狗腎傳代細胞（MDCK-P13），由全國流感中心提供。

1.1.4 病毒 甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒，批號：09712，由全國流感中心提供。

1.1.5 實驗室及其他實驗材料 生物安全三級實驗室BSL-3：編號：CNAS/BLA/T003，由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供。其他實驗材料還有來源華美公司的四甲基噻唑藍（MTT）、D-MEM培養基（高糖含-谷氨酰胺，進口GIBCO）、胎牛血清（進口GIBCO）、牛血清白蛋白組分（進口GIBCO）、青酶素、鏈酶素、HEPES緩沖液（進口GIBCO）、TPCK-胰酶（牛胰腺來源VⅢ型，進口GIBCO）、Hank's溶液、二甲基亞楓（進口GIBCO）、倒置可視顯微鏡（OLYMPUS）、一次性實驗耗材及試劑等（進口GIBCO公司）；3M公司的個人防護裝備；本室的CO2培養箱NUAIR USAUTOFLOW。

2 實驗方法

2.1 牛黃清感膠囊對甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒抑制作用

2.1.1 病毒CPE法

2.1.1.1 細胞培養 MDCK細胞以40萬/mL的濃度接種96孔培養板，培養基為L-谷氨酸完全型D-MEM、10%的進口特級胎牛血清。37℃ 5% CO2孵箱培養至細胞對數生長期最旺盛75%～90%成片細胞，棄掉細胞培養液，采用Hank’s溶液洗細胞2次。

2.1.1.2 病毒吸附 將100TCID50甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒（采用病毒生長液（D-MEM培養基中含牛血清白蛋白組分12.5mL、青酶素100U/mL、鏈酶素100μg/mL，HEPES 12.5mL，TPCK-胰酶0.5mL）稀釋后，接種經處理的MDCK細胞96孔培養板，每孔100μL，同時設病毒對照（100TCID50病毒液）。36℃、5% CO2孵箱中吸附2h，棄掉病毒稀釋液，采用Hank's溶液洗2次。

2.1.1.3 藥物稀釋 牛黃清感膠囊，選用對細胞的最大無毒濃度（TD0）2倍稀釋8個濃度即750～5.9μg/mL。同時設利巴韋林注射液陽性藥物對照，選用對細胞的最大無毒濃度（TD0）2倍稀釋 9個濃度，即 1000～ 3.9μg/mL，每濃度接種感染細胞3孔，每孔100μL。實驗分1次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的MDCK細胞1次），3次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的MDCK細胞，每24小時棄掉舊藥液，換同濃度的藥液，連續3次）。36℃、5% CO2孵箱培養，每24小時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態CPE變化，以25%以下細胞形態CPE變化為“+”，26%～50%細胞形態CPE變化為“++”，51%～75%細胞形態CPE變化為“+++”，76%～100%細胞形態CPE變化為“++++”，至病毒對照出現“++++”時結束實驗，用Reed-Muench法，計算藥物半數有效濃度（IC50）和最小有效濃度（MIC）及治療指數（TI）判斷藥效。實驗重復3次。

2.1.2 病毒MTT染色法

觀察細胞病變CPE結果后，加入MTT 5mg/mL，每孔10μL，置37℃培養4h，然后加入100μL DMSO有機溶劑，室溫20min，充分溶解細胞（過程中稍加震蕩）。然后，采用酶標儀波長570nm測定，記錄OD值，計算藥物半數有效濃度IC50和最小有效濃度MIC及治療指數TI，判斷藥效。實驗重復3次。

2.2 牛黃清感膠囊對甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的預防作用

2.2.1 病毒CPE法

2.2.1.1 細胞培養 按2.1.1.1的方法。

2.2.1.2 藥物作用細胞 牛黃清感膠囊，選用對細胞的最大無毒濃度（TD0）2倍稀釋8個濃度，即750～5.9μg/mL，同時設利巴韋林注射液陽性藥物對照，2倍稀釋9個濃度1000～3.9μg/mL，每濃度接種感染細胞3孔，每孔100μL。實驗分1次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的MDCK細胞1次），3次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的MDCK細胞，每24小時棄掉舊藥液，換同濃度的藥液，連續3次）。

2.2.1.3 病毒攻擊 將100TCID50甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒（采用病毒生長液（D-MEM培養基中含牛血清白蛋白組分12.5mL、青酶素100U/mL、鏈酶素100μg/mL，HEPES 12.5mL，TPCK-胰酶0.5mL）稀釋后，接種經藥物作用的MDCK細胞96孔培養板，每孔100μL，同時設病毒對照（100TCID50病毒液），設正常細胞對照。36℃、5% CO2孵箱中吸附2h，棄掉病毒稀釋液，采用Hank's溶液洗2次。

2.2.1.4 細胞培養及觀察 每孔加入100μL病毒生長液，36℃、5% CO2孵箱培養，每24小時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態CPE變化，按2.1.1.3的指標判斷藥效。實驗重復3次。

2.2.2 病毒MTT染色法

按2.1.2的方法。

3 實驗結果

3.1 牛黃清感膠囊體外抑制甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒藥效實驗結果

在MDCK細胞培養內，采用病毒CPE法和MTT染色法，檢測牛黃清感膠囊對甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的抑制作用，實驗分不同濃度的受試藥液作用被病毒感染的MDCK細胞1次組和3次組。用Probit回歸法計算藥物的半數有效濃度IC50，最小有效濃度MIC及治療指數TI，3次實驗結果見表1。

表1 不同濃度“牛黃清感膠囊”體外抑制甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒藥效

3.2 牛黃清感膠囊體外預防甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒藥效實驗結果

在MDCK細胞培養內，采用病毒細胞形態變化CPE法、MTT染色法，檢測不同濃度的牛黃清感膠囊對甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的預防作用。實驗分1次用藥組和3次用藥組，用Probit回歸法計算計算藥物的半數有效濃度IC50，最小有效濃度MIC及治療指數TI。3次實驗結果見表2。

表2 不同濃度“牛黃清感膠囊”體外預防甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒藥效

4 討論

流行性感冒一直是世界高發的傳染病之一，每年全球約有6億人患流感，占總人口的10%。我國是世界上公認的流感多發地甚至是發源地，其機制尚不清楚。其中曾經引起世界性大流行的A（H3N2）亞型流感病毒自1968年以來一直在人群中存在[2]。流感病毒的抗原變異與流感的發生和流行密切相關，流感病毒正是通過不斷改變其抗原性來逃避宿主特異性免疫的識別和清除，從而不斷引起流行[3-4]。

國內外有關抗病毒中藥的研究日益增多，從中篩選其有效成分已成為當前抗病毒新藥研發的一個熱點[5]。牛黃是一種常用的名貴中藥，味苦、甘，性涼。歸心、肝經。具有清心解毒、涼肝息風、豁痰開竅等功效。現代藥理學方法研究結果顯示，生物牛黃中間體在雞胚成纖維細胞上使新城疫系疫苗毒的TCID50升高1個滴度[6]。金銀花具有清熱解毒，涼散風熱之功效，有研究[7]發現金銀花具有明顯的抗病毒作用，其有效活性成分為綠原酸類化合物，金銀花的抗病毒作用多是由其有效活性成分直接作用于病毒，對DNA和RNA病毒均有一定的抑制作用。金銀花提取物20g/kg和40g/kg劑量組可明顯延長甲型流感病毒感染小鼠的存活天數，顯著降低甲型流感病毒感染小鼠死亡數，對甲型流感病毒（A/PR/8/34）感染小鼠具有明顯的保護作用，同時可明顯降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指數值，具有減輕甲型流感病毒小鼠肺部病變的作用[8]。黃芩始載于《神農本草經》，為唇形科植物黃芩的干燥根，有清熱燥濕、瀉火解毒之效。黃芩具有多種藥理作用，除抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤作用外，對多種病毒，如乙肝病毒、HIV等均具有抑制作用[9]。目前研究認為，黃芩的有效成分是黃酮類化合物，研究表明黃芩苷對流感病毒所致的細胞病變作用有明顯的抑制作用，可較強地抑制小鼠感染流感病毒及明顯阻礙流感病毒對小鼠的致死活性，對流感病毒的唾液酸酶有特異的抑制活性，并抑制流感病毒的膜融合及脫殼[10]。連翹對多種病毒具有抑制作用，連翹抗病毒有效部位（LC-4）在體外對呼吸道合胞病毒（RSV）有明顯的預防作用及治療作用[11]。

牛黃清感膠囊是由牛黃、金銀花、黃芩、連翹等組成的復方制劑[12]，我們對甲型H3N2流感病毒的實驗結果表明牛黃清感膠囊具有體外抑制和預防高致病甲型H3N2流感病毒的作用，同濃度的稀釋藥液連續3次作用正常的MDCK細胞和被病毒感染的細胞，能夠有效的抑制和預防高致病甲型H1N1流感病毒的繁殖。

[1] 劉釗，楊占秋，肖紅，等.MTT法在抗病毒藥物篩選中的應用[J].武漢大學學報（醫學版），2004，25（3）：332-334.

[2] 杜寧，楊霄星，藍雨，等.1968年香港流感（H3N2）病原學概述[J].病毒學報，2009，25（增刊）：17-20.

[3] Nobusawa E，Nakajim K.Amino acid substitution of position 226 of the hemaglutinin molecule of influenza (H1N1) virus affects receptobinding activity but not fusion activity[J].Virology，1988，167（23）：8-14.

[4] Isabelle H，Yan L，Michael B，et a1.Molecular evolution of influenza AH3N2 viruses in the provinces of Quebec（Canada） during the 1997-2000 period[J].Virus Res，2001，77（9）：89-96.

[5] 廖玲，王紅.中藥治療巨細胞病毒感染研究進展[J].北京中醫藥，2011，30（1）：64-67.

[6] 付本懂，張繼東，鐘秀會，等.生物牛黃中間體的抗病毒作用及對家兔血液流變學指標的影響[J].中國獸醫學報，2005，25（3）：278-280.

[7] 季志平，朱萱萱，倪文澎，等.金銀花提取物抗病毒的作用研究[J].中國醫藥導刊，2009，11（1）：118.

[8] 管仲瑩，趙金明，林巧智.金銀花提取物抑菌作用的實驗研究[J].中國現代醫生，2009，47（15）：150-151.

[9] 吳瑩，金葉智，吳珺，等.黃芩主要成分體外抗甲型流感病毒作用的研究 [J].北京中醫藥大學學報，2010，33（8）：541-545.

[10] 袁國秀.牛黃解毒片中黃芩苷的含量測定[J].中國社區醫師（醫學專業），2011，23（1）：3.

[11] 陳楊，李鑫，周婧瑜，等.連翹抗病毒有效部位（LC-4）體外抗呼吸道合胞病毒作用的研究[J].衛生研究，2009，21（6）：79-81.

[12] 常洋.牛黃清感膠囊毒理研究[J].黑龍江科技信息，2011，5（16）：72.