人骨髓間充質干細胞移植對輻射NOD /SCID小鼠造血重建的影響

胡佳樂 徐立軍 徐之明 陳海飛 沈紅石 李征洋 唐杰慶 王 靜 吳天勤

隨著腫瘤發生率的增高，腫瘤放射治療也隨著增多。接受放療的惡性腫瘤患者的機體都不可避免遭受到放射、輻射帶來的傷害。然而，大劑量的放療、化療可損傷骨髓基質細胞，嚴重影響造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)的植入及造血功能的恢復[1～3]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是存在于骨髓中的1種具有多向分化潛能的干細胞，可以增殖分化為各種骨髓基質細胞，能分泌多種造血調節因子，在造血調控過程中起著非常重要作用[4～6]。MSC的異常可引起間質細胞的生長過度或停滯和引起造血調節因子的分泌異常，最終可導致造血系統紊亂[7]。因此，我們將體外培養擴增的人骨髓MSC(hBMSC)與人臍血(umbilical cord blood，UCB)CD34+造血干細胞(UCB HSC)共移植給經60Co γ射線照射的NOD/SCID小鼠，觀察其對造血重建的影響，為hBMSC臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 共體細胞

hBMSC，由本實驗室分離、培養和鑒定(相關資料另文發表)；UCB HSC，購自中國醫學科學院血液病研究所。

1.2 實驗動物及分組

30只NOD/SCID小鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心，6～8周齡，體重18～20 g，小鼠飼養于SPF級環境中，飼料、飲水、墊料及籠具等物品均經高壓蒸氣滅菌。隨機平均分成5組，除正常對照組(未照射組6只)外，另4組24只NOD/SCID小鼠均給予60Co γ射線照射，照射劑量為350 cGy，劑量率為20 cGy/min。除陰性對照組6只不輸入任何細胞，另3組實驗組(18只)經60Co γ射線照射的NOD/SCID小鼠作為細胞移植受體[8]。

1.3 細胞移植

3組實驗組小鼠照射后4 h內經外側尾靜脈輸注上述供體細胞，每只小鼠液體總輸注量為0.2 ml。實驗1組：6只，單純輸入UCB HSC 5×106/ml；實驗2組：6只，輸入UCB HSC 5×106/ml和hBMSC 5×106/ml；實驗3組：6只，輸入UCB HSC 5×106/ml和hBMSC 5×108/ml。

1.4 觀測指標

細胞移植后繼續無菌飲食喂養，觀察各組小鼠的一般情況和形態變化，包括小鼠存活情況，皮膚黏膜是否有潰爛、出血，毛發有無缺損等。移植3周后，每周尾靜脈取血，檢測外周血單個核細胞(MNC)的數量。移植6周后，檢測人源供體細胞嵌合情況：實驗組小鼠斷頸處死后，取其股骨骨髓，制成骨髓細胞懸液100 μl，并調整細胞濃度至1×106/ml，加入20 μl FITC標記的單抗CD45，室溫下避光孵育30 min，再加入2 ml溶血素，室溫下作用10 min，然后用PBS液洗滌2次，加PBS液至0.5 ml，上機檢測。陰性對照：鼠抗鼠IgG1-FITC直標。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 移植后小鼠外觀情況

陰性對照組和實驗1組小鼠均于2周內死亡，經病理檢查確診，均死于骨髓衰竭。實驗2、3組小鼠均存活，并保持良好的生存狀態，皮膚黏膜無潰爛、出血現象，毛發無缺損，未發生明顯的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，移植4周后，狀態接近正常對照組。

2.2 移植后小鼠血象情況

移植后第3周，實驗3組外周血MNC數量為(2.66±0.24)×109/L，高于實驗2組(1.35 ± 0.20)×109/L(P<0.01)；實驗2、3組外周血象逐漸回升；第5周，實驗2、3組外周血中MNC水平均接近正常值(表1)。

表1 外周血MNC數量變化

2.3 移植后小鼠供體細胞嵌合情況

移植后第7周，實驗2、3組小鼠外周血均檢測出供體細胞；實驗3組人源細胞嵌合比例為(7.45±0.72)%，高于實驗2組[(5.12±0.06)%] (P<0.05)。

3 討論

本組研究發現，經60Co γ射線照射NOD/SCID小鼠，不輸注細胞和單純輸注UCB HSC的2組小鼠均于2周內死于造血功能衰竭；而聯合輸入UCB HSC和hBMSC的 2組小鼠在移植后造血均獲重建，皮膚黏膜無潰爛、出血現象，也無明顯GVHD發生。說明單純輸入UCB HSC，植活困難；UCB HSC的成功植入和造血的重建必須有基質成分的協同作用。本研究結果還顯示，UCB HSC聯合hBMSC移植時，效果與hBMSC用量有關，與5×106/ml組比較，hBMSC用量為5×108/ml組小鼠外周血MNC含量較高，外周血象恢復也較快；穩定植入后，供體細胞嵌合率較高。這可能與hBMSC為造血提供了重要的細胞間接觸和生長因子有關[9，10]。hBMSC也可能通過誘導歸巢受體表達而引導造血干細胞歸巢[11]，還可能是基質細胞組分重建后分泌的大量UCB HSC生長刺激因子，誘導了部分hBMSC向造血細胞的分化[12]。總之，NOD/SCID小鼠致死劑量照射后，聯合輸入UCB HSC和hBMSC可明顯促進造血干細胞移植后的造血重建，且輸入hBMSC并不增高GVHD發生率，這為臨床應用hBMSC聯合UCB HSC移植治療造血障礙性疾病及多種惡性血液病提供了科學依據。

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