甘氨雙唑鈉對離體乏氧喉癌細胞放射增敏作用的實驗研究

李 響 梁健剛 關 中 徐志堅 彭解人

喉癌是近年來發(fā)病率逐漸提高的1種頭頸部常見的惡性腫瘤。放射治療可保留喉功能，提高患者生存質量，在喉癌的綜合治療中起著重要的作用，但是腫瘤細胞的乏氧狀態(tài)可導致放射耐受、放療失敗[1，2]。研究表明，乏氧不僅影響放療效果，還是影響手術治療[3]及某些化療藥物治療效果[4]的不良因素。放射增敏法為解決乏氧耐受的1種重要方法，甘氨雙唑鈉是1種具有良好的放療增敏效應且不良反應較低的放射增敏劑。臨床研究表明其可提高頭頸部腫瘤的療效，但主要入選病例為鼻咽癌及口咽癌患者，尚無針對喉癌的基礎研究及臨床隨機雙盲試驗研究。本研究觀察甘氨雙唑鈉對離體乏氧人喉癌細胞株(Hep-2)的放射增敏作用，并初步探討其放射增敏機制，以期為喉癌的臨床放射增敏治療提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喉癌細胞株Hep-2購自中南大學中心實驗室，放射增敏劑甘氨雙唑鈉(商品名希美納)購自山東綠葉制藥有限公司，99.99%氮氣購自廣州氣體廠，培養(yǎng)基RPMI 1640購自GIBCO公司。德國西門子PRIMUS直線加速器。

1.2 細胞培養(yǎng)

喉癌細胞株Hep-2采用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%新生牛血清)，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

1.3 乏氧細胞建立方法

實驗組為乏氧照射組，對照組為常氧照射組。實驗組選擇處于對數(shù)生長期的喉癌細胞(Hep-2)，向培養(yǎng)瓶內通入99.99%的高純氮(流量0.5 L/min，時間45 min)進行乏氧，兩組均予0 Gy、2 Gy、4 Gy、8 Gy、12 Gy、16 Gy照射劑量，分別單次照射后，接種6孔板，通過克隆形成試驗，驗證乏氧模型的建立。

1.4 照射方法

6MV直線加速器，照射劑量為200 cGy/min,X線照射，源皮距為100 cm，射野大小為20 cm×20 cm。

1.5 MTT法檢測細胞增殖抑制及活性差異

實驗組為加藥乏氧照射組，并根據(jù)CMNa的不同濃度(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L)分為3組；不加藥單純乏氧照射組為對照組。照射劑量為4 Gy、8 Gy。將處于對數(shù)生長期的細胞制備成單細胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，調整細胞數(shù)，使每瓶為5×105個。實驗組及對照組均先進行乏氧，然后加入藥物進行照射。照射后以每孔約2 000個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h 后應用酶標儀在490 nm處測定各孔吸光度OD值，計算腫瘤細胞抑制率。腫瘤細胞存活率(%)=(加藥孔細胞OD值/對照孔細胞OD值)×100%。腫瘤細胞抑制率(%)=1-腫瘤細胞存活率。

1.6 克隆形成試驗檢測CMNa對乏氧Hep-2細胞的放射增敏作用

實驗分組同1.5。按上述方法進行乏氧、加藥及放射處理(0、2 、4 、8 、12 及16 Gy照射劑量)2 h后，分別梯度接種細胞于6孔板中，每組重復3次。7～10天后肉眼可見細胞克隆時，停止培養(yǎng)，結晶紫染色。光鏡下觀察，計數(shù)大于50個細胞的集落數(shù)。克隆接種率(PE)=(對照組克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%；存活分數(shù)(SF)=克隆數(shù)/(接種細胞數(shù)×PE) ；應用多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)n擬合劑量存活曲線，得出N、D0、Dq和SF2等放射生物學參數(shù)；根據(jù)D0、Dq值，按公式增敏比(SER)=單純乏氧對照組D0/增敏乏氧實驗組D0，計算CMNa的放射增敏比。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期變化

將實驗各組照射2 h后的細胞樣品處理后，應用流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 乏氧細胞的建立

根據(jù)數(shù)據(jù)(表1)，應用多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)n擬合劑量存活曲線，計算常氧狀態(tài)D0為0.71，乏氧狀態(tài)D0為1.88，氧增比OER為2.63，其值介于2.5～3.0時，認為達到乏氧條件。

表1 乏氧組與常氧對照組克隆平均數(shù)±s)

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制及活性的差異

MTT實驗結果顯示同一放射劑量下，乏氧細胞的OD值隨甘氨雙唑鈉濃度的增高而減少，不同放射劑量下，細胞生長抑制曲線隨劑量增大而增陡(表2)。由單因素方差分析得F4 Gy=19.6，F(xiàn)8 Gy=21.5,P4 Gy=0.023,P8 Gy=0.029,P<0.05，進一步經Dunnett-t檢驗，同一照射劑量下任意實驗組與對照組在細胞生長情況上均具有統(tǒng)計學差異，初步判斷甘氨雙唑鈉對離體乏氧細胞具有放射增敏作用。

表2 4 Gy及8 Gy劑量照射后不同濃度甘氨雙唑鈉的放射增敏作用±s)

2.3 克隆形成試驗檢測CMNa的放射增敏作用

加入不同濃度CMNa的乏氧放射組和單純乏氧放射組的細胞劑量存活曲線見圖1，其SER、D0、Dq及SF2的值見表3。表明在不同放射劑量下，CMNa的SER值隨濃度增大而增加，D0、Dq及SF2值隨濃度增大而減小。

表3 不同濃度甘氨雙唑鈉放射增敏作用的放射生物學參數(shù)

2.4 CMNa聯(lián)合放療對乏氧Hep-2細胞周期的影響

流式細胞儀檢測甘氨雙唑鈉作用于乏氧喉癌細胞后，檢測細胞周期的改變見表4和圖2。結果顯示在同一劑量照射下，與單純乏氧對照組比較，甘氨雙唑鈉作用于乏氧喉癌細胞后，使G2/M期細胞比例上升，G1/S期細胞比例下降。單因素方差分析及Dunnett-t檢驗結果顯示：同一照射劑量、不同濃度甘氨雙唑鈉作用乏氧細胞后，G2/M期細胞比例呈上升趨勢(F=4.41,P=0.004<0.05)，G1/S期細胞比例呈下降趨勢(F=7.93,P=0.012<0.05)，呈濃度依賴性。

表4 不同照射劑量各組細胞周期的改變±s)

圖1 各組照射后乏氧喉癌細胞生存曲線圖

圖2 4 Gy照射劑量下各組細胞周期的改變

3 討論

喉癌作為1種對放射中度敏感的惡性實體腫瘤，腫瘤內存在相當一部分的乏氧細胞是其產生放射抗拒的主要原因[5,6]。甘氨雙唑鈉是1種新型的乏氧細胞增敏劑，但目前基礎實驗報道多為甘氨雙唑鈉對常氧狀態(tài)下腫瘤細胞的影響[7]，尚未對乏氧喉癌細胞的研究。臨床研究報道中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗[8,9]表明甘氨雙唑鈉可提高頭頸部腫瘤、食管癌[10]、肺癌的CR，但主要入選病例為鼻咽癌及口咽癌患者。因此，本實驗探索CMNa對乏氧Hep細胞是否有放射增敏作用。

根據(jù)文獻報道[11]，CMNa對乏氧細胞的IC50分別為35.7 mmo1/L和23.50 mmo1/L,可采用 0.1～1.38 mmo1/L對離體細胞進行增敏。本實驗選擇CMNa濃度為0.1 mmo1/L、0.5 mmo1/L和1.0 mmo1/L，遠小于IC50的低細胞毒性(20%IC50以下3～4個濃度)的有效濃度進行增敏試驗。

乏氧方法目前已有專門的乏氧細胞培養(yǎng)箱，但受限于實驗設備條件，本實驗根據(jù)傳統(tǒng)乏氧方法[12]進行乏氧并驗證模型成立。

MTT實驗結果顯示，CMNa組存活率(OD值)均顯著低于不加藥的對照組，且隨CMNa濃度的增加而下降，初步驗證CMNa的放射增敏作用。但該方法具有一定局限性，即MTT結晶物形成的量與活細胞數(shù)成正比，但無法衡量腫瘤細胞的無限增殖活性。

克隆形成實驗是評估照射殺傷效果的經典方法，照射之后能夠形成克隆的被認為是有無限分裂能力的腫瘤細胞，可彌補MTT法的不足。克隆形成實驗結果表明CMNa對離體乏氧喉癌細胞具有明顯的放射增敏作用。在不同藥物濃度下，CMNa的SER值隨濃度增大而增加，D0、Dq及SF2值隨濃度增大而減小，說明CMNa對乏氧細胞的放射增敏性隨濃度增大而增強，放射抵抗性隨濃度增大而減弱，呈濃度依賴關系。

在增敏機制方面，1963年Adams提出的“親電子理論”指出放射增敏劑可使受放射損失的靶分子自由基不能重獲電子而影響修復，增加射線對腫瘤細胞的原發(fā)性損傷。隨著分子生物學的發(fā)展，更多的放射增敏機制被揭示出來，如通過分子靶向藥物及細胞信號通路傳導途徑[13]、細胞周期調控[14]、促進凋亡[15]、抑制DNA雙鏈斷裂修復[16]等。

細胞周期調控理論指出處于細胞周期不同時相的細胞其放射敏感性具有很大差異。其中，G2/M期放射敏感性最高，G1/S期次之，S后期及G1期具有很強的放射抵抗性[17]。因此，促使腫瘤細胞由放射抵抗的G1/S期進入并阻滯在G2/M期，是提高腫瘤放射敏感性、改善放療效果的重要途徑。本實驗發(fā)現(xiàn)甘氨雙唑鈉放射增敏機制除增加對DNA原發(fā)性損傷外，還與細胞周期調控有關。不同濃度甘氨雙唑鈉作用后，乏氧喉癌細胞G2/M期細胞比例有上升趨勢，而G1/S期細胞比例具有下降趨勢，統(tǒng)計分析表明甘氨雙唑鈉可以促進細胞進入并阻滯在放射敏感的G2/M期，具有統(tǒng)計學差異，呈劑量依賴關系。

綜上所述，甘氨雙唑鈉對乏氧喉癌Hep-2腫瘤細胞具有放射增敏性，其機制可能與促進細胞進入放射敏感的G2/M期有關，但對于喉癌患者的放射增敏作用還有待專門針對喉癌的臨床隨機實驗研究。

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