2-脫氧-D-葡萄糖對人卵巢癌SKOV-3增殖的影響

陸冰穎 余進進 李澤明

2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)為葡萄糖類似物，具有抑制病毒及細菌感染及延緩衰老等作用，作為糖酵解抑制劑的1種，基于“瓦博格效應”的抗腫瘤潛在能力受到關注，已有研究顯示，2-DG可抑制某些腫瘤細胞的增殖，但對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響尚少見報告，本研究觀察了體外環境下2-DG對人卵巢癌增殖及凋亡的影響，為卵巢癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人卵巢癌SKOV-3細胞株由復旦大學附屬婦產科醫院饋贈；實驗藥物2-脫氧-D-葡萄糖購自Alfa Aesar公司；RPMI-1640、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司；0.25%不含EDTA胰酶購自杭州吉諾公司；標準新生牛血清購自杭州四季青生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人卵巢癌SKOV-3細胞培養在含10%新生牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，2天換液1次，待細胞鋪滿瓶底70%～80%時，用PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液繼續傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT檢測細胞抑制率 取對數生長期細胞，用胰酶消化制成單細胞懸液后，調整細胞密度為5 000個/100 μl，接種于 96 孔板中，每組設6個復孔，置于恒溫培養箱中培養24 h，吸盡培養基，加入不同濃度的藥物(2.5 mmol/L、5 mmol/L 、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L)各100 μl，置于培養箱中繼續培養，實驗終止前4 h每孔加入50 μl的1×MTT，繼續培養4 h，吸盡上清液，每孔加入DMSO 150 μl，微振蕩器上振蕩溶解10 min，以空白對照孔調零，在自動酶標儀490 nm波長處測定每孔的吸光度(A)值。細胞抑制率(%)= 1-(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。實驗重復3次。

1.2.3 Hoechst染色觀察細胞凋亡 取對數生長期細胞，以最適細胞濃度接種于96孔板中，設陰性對照組及10 mmol/L 2-DG處理組，繼續培養細胞48 h，棄上清，加入適量Hoechst33258染液，室溫避光反應10 min后于熒光倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取對數生長期的SKOV-3細胞，PBS洗兩遍，消化制成單細胞懸液，調整細胞濃度為50萬個/ml接種于六孔板中，培養24 h后，分別加入不同濃度的2-DG(5 mmol/L 、10 mmol/L、20 mmol/L)2 ml，繼續培養48 h，收集單細胞懸液，低速離心5 min(1 000轉/min)后棄上清，冷PBS洗2次，緩慢加入預冷70%無水乙醇1 ml，4℃固定過夜。低速離心5 min(1000轉/min)棄上清，冷PBS洗2次，加入100 μl Rnase A置于37℃水浴30 min，加入400 μl PI避光染色混勻，4℃避光反應30 min，上機檢測。實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡或壞死 取對數生長期細胞，以50萬個/ml的濃度接種于6孔板中，培養24 h后，加入10 mmol/L 2-DG 2 ml，繼續培養24 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，冷PBS洗2次(1000轉/min)，加入500 μl的Binding Buffer緩沖液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，再加入5 μl PI混勻，室溫下避光反應10～15 min，上機檢測。實驗重復3次。

1.3 統計學處理

應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，采用完全隨機設計的單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞抑制率

2-DG對SKOV-3細胞抑制作用見圖1。2-DG可抑制SKOV-3細胞生長，且這種抑制作用隨作用濃度的增加或作用時間的延長而增強，具有劑量和時間依賴性(P<0.05)。

圖1 不同濃度2-DG對SKOV-3細胞抑制率

2.2 Hoechst染色觀察細胞凋亡

經Hoechst染色后于熒光顯微鏡下觀察發現，對照組SKOV-3細胞核比較大，熒光分布較均勻且較弱；2-DG作用24 h后，可見SKOV-3細胞呈不同程度核皺縮、破裂及染色質濃縮、邊移，形態不規則，可見凋亡小體，熒光下成高亮，即典型的細胞凋亡形態，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下細胞凋亡形態變化

2.3 2-DG對人卵巢癌SKOV-3細胞周期的影響

由表1可見，隨著2-DG濃度增加，處于G0/G1期的人SKOV-3細胞逐漸增多，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，結果表明2-DG通過阻滯細胞于G0/G1期，從而達到抑制細胞增殖的作用。

表1 2-DG對人卵巢癌SKOV-3細胞周期的影響

2.4 2-DG對人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡的影響(圖3)

流式細胞儀檢測結果顯示：對照組(A)細胞凋亡率為(2.94±0.45)%；2-DG處理組(B)細胞凋亡率為(17.45±0.62)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 流式細胞術檢測SKOV-3細胞凋亡情況

3 討論

體內大多數正常細胞(紅細胞等除外)主要通過葡萄糖的有氧氧化獲得ATP，而腫瘤細胞即使在有氧條件下仍依靠糖酵解獲取能量，這就是“瓦博格效應”[1]，由于糖酵解產生的能量遠少于有氧氧化的產量，導致腫瘤細胞需要更多的葡萄糖來維持生長代謝，基于腫瘤細胞代謝的這種特點，以18F標記的2-DG通過正電子發射斷層掃描成像(PET-CT)來作為早期發現和診斷腫瘤疾病的手段之一，也再次引起人們對“瓦博格效應”的關注[2]。

2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)又名2-去氧甘露糖、2-去氧-D-阿拉伯已糖或天然無毒單糖，非代謝型天然稀有六碳糖，是多柔比星、正定霉素、洋紅霉素及大環內脂類抗生素等抗癌藥物的基本結構單位[3]。已有研究顯示，2-DG進入細胞后被已糖激酶磷酸化，生成的2-DG-6P不能被代謝，從而聚積在細胞內，競爭性抑制已糖激酶與葡萄糖的反應，減少G-6-P的生成，限制了糖酵解后繼反應的發生，減少了ATP的生成，從而導致腫瘤細胞的周期阻滯和死亡[4]。Kern等[5]把F344大鼠分為3組，皮下接種不同數量的纖維肉瘤細胞(2×106個細胞，1×107個細胞和1 mm腫瘤組織)，于接種后第3天隨機分配接受不同濃度2-DG(劑量分別為0.75 g/kg、1.5 g/kg、1.75 g/kg，)處理，生理鹽水作為對照組，10天后收集腫瘤細胞與對照組比較，實驗組腫瘤細胞重量減少50%～70%，且細胞毒性隨著2-DG濃度的增加而增強。已有研究顯示在移植人骨肉瘤和非小細胞肺癌的裸鼠實驗中，2-DG可提高阿霉素或紫杉醇抗腫瘤作用[6]。

本實驗研究發現，不同濃度2-DG對人卵巢癌SKOV-3具有增殖抑制作用：MTT比色法顯示2-DG可抑制細胞增殖，且具有時間和濃度依賴性；Hoechst染色可在熒光顯微鏡下觀察到凋亡小體及細胞核不同的形態變化；細胞周期結果顯示，2-DG可阻滯卵巢癌SKO-V-3細胞于G0/G1期，可能是2-DG作用于細胞的S期，抑制DNA合成，阻礙細胞由G1期向S期轉化，導致G0/G1期細胞增多，從而減慢了腫瘤細胞的增殖速度；細胞凋亡流式細胞術結果顯示，2-DG處理組的凋亡區和壞死區的細胞較對照組明顯增多，表明2-DG是通過壞死和凋亡誘導細胞死亡的。

有研究顯示，2-DG可以以劑量依賴性方式，通過選擇性增敏腫瘤細胞提高放療有效性的同時保護正常細胞，Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗表明，腦膠質瘤患者口服劑量為200 mg/kg，接受γ射線輻射治療的患者仍能很好的耐受[7]。

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，其死亡率高居婦科惡性腫瘤之首，目前臨床治療原則以手術為主，輔以化療等綜合治療[8]，但由于抗腫瘤藥物對體內正常細胞的殺傷作用以及耐藥的產生，使尋求新的治療藥物成為迫切需要。2-DG已被驗證可以在多個腫瘤細胞中阻滯細胞周期并可誘導細胞凋亡，深入研究2-DG作用機制可能成為治療腫瘤的新手段。

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