卵巢癌組織中TLR4表達及其臨床意義

馬 玲

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是1種以廣泛轉移為特征的發生在卵巢上皮細胞、基質及生殖細胞的惡性腫瘤,女性發病率約為1/70，且預后差。大部分卵巢癌患者發病早期無明顯的臨床表現，現在也無有效的篩查方法，所以大多數患者在診斷時已經為腫瘤Ⅲ期或者Ⅳ期。在疾病晚期，遠處轉移不可避免，預后更差，長期存活率約為20%[1]。為了提高卵巢癌患者的生存率，尋找能夠獨立或者輔助傳統手術及化學藥物治療的新的途徑和治療方法勢在必行。

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是1種跨膜蛋白，可感應入侵的病原微生物，主要存在于免疫細胞內，如樹突狀細胞及巨噬細胞[2]。近年來，研究發現TLRs與腫瘤的進展關系密切。已有證據證明腫瘤細胞可以利用TLR信號轉導過程來利于自身的生長。TLR配體可通過刺激炎癥因子，尤其是NF-kB的活性來促進腫瘤的生長[3]。尤其是對于卵巢腫瘤，Zhou等發現TLR2、TLR3、TLR4及TLR5均在正常卵巢上皮及新生卵巢上皮細胞腫瘤中呈高表達[4]。也有學者發現，TLR4在卵巢顆粒細胞腫瘤細胞中表達增強[5]。本研究通過檢測卵巢癌組織中TLR4表達，同時分析TLR4表達與卵巢癌臨床特征的關系，以探討TLR4表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本的收集

2010年3月至2012年3月，我院婦科收治卵巢癌患者40例，平均年齡(43.8±7.7)歲。均經術后病理檢查證實，其中漿液性囊腺癌16例，黏液性囊腺癌12例，子宮內膜樣腺癌9例，透明細胞癌1例，未分化癌2例。采用國際婦產科聯盟(FIGO)2000年臨床分期標準，Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例。組織分化程度：高分化10例，中分化13例，低分化17例。淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移22例。術前均未接受放、化療或者激素治療。

手術切除后，立即采集卵巢癌組織及相應的癌旁組織(距腫瘤邊緣2～3 cm)，立即放入液氮中，-80℃保存。以30例正常卵巢組織標本作為對照，取自同期因子宮或者卵巢良性病變而行手術者，并經術后病理檢查證實為正常卵巢組織，患者年齡為(45.6±6.7)歲。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆抗體TLR4購自Sigma公司，Western blot試劑盒購自Pierce公司，蛋白質定量試劑盒、組織蛋白抽提試劑盒購自上海康成公司，Trizol試劑購自Invitrogen life technology，RNA引物由上海英俊公司合成。

1.3 主要儀器

2720型PCR擴增儀為AB公司產品，J2-MC離心機為Beckman公司產品，721分光度計由上海分析儀器廠生產，Western blot實驗設備均為Bio-Rad公司產品。

1.4 RT-PCR檢測TLR4 mRNA的表達

采用Trizol試劑提取總RNA，經逆轉錄獲取cDNA。取2 μl逆轉錄產物行PCR反應。TLR4基因引物序列：上游引物為5’GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3’，下游引物為5’GGTCCAGGTTCTTGGTTGAG3’，擴增產物長度為255 bp。反應體系總體積為50 μl。反應條件：95℃ 30 s，58℃ 45 s，70℃ 1 min，28個循環。取10 μl反應產物，2%瓊脂糖凝膠電泳分離照相，以TLR4灰度積分與相應β-actin灰度積分的比值作為TLR4相對表達強度，重復實驗3次。

1.5 Western blot方法檢測TLR4蛋白表達

取組織標本，在緩沖液中勻漿，冰浴10 min，4℃、14 000 r/min，離心15 min。提取總蛋白進行蛋白定量。取上清，水煮變性后，按照蛋白定量結果進行加樣，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉37℃封閉。PBS洗滌后，加入兔抗人TLR4抗體(1∶100)工作液，4℃過夜。充分洗滌后，加羊抗鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。PBS漂洗后成像，分析檢測結果，以β-actin作為內參照，計算吸光度(A)比值，重復實驗3次。

1.6 統計學方法

應用SPSS13.0軟件進行統計學分析。計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Western blot檢測結果

卵巢癌組織中TLR4表達量明顯高于相應的癌旁組織及正常卵巢組織；灰度分析結果顯示，卵巢癌組織、癌旁組織和正常卵巢組織中其相對表達量分別為0.801±0.073、0.399±0.078和0.134±0.059，卵巢癌組織中TLR4表達量明顯高于相應的癌旁組織及正常卵巢組織(P<0.05)。

2.2 RT-PCR檢測結果

實時定量PCR檢測TLR4 mRNA水平，結果與免疫組化及Western blot結果相一致，TLR4 mRNA表達量卵巢癌組織明顯高于癌旁組織和正常卵巢組織(0.0647±0.0253、0.0350±0.0220、0.0167±0.0136，P<0.05)。

2.3 TLR4表達與卵巢癌臨床病理特征的關系

40例卵巢癌組織中，TLR4蛋白表達與腫瘤分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與腫瘤大小、病理類型無關(P>0.05),見表1。

3 討論

TLR4是TLRs中的1個亞型，它是在哺乳動物中最早被發現的與果蠅Toll受體高度同源的TLR。TLR通過激活免疫細胞使機體產生內源性或外源性免疫應答。已有多種研究表明TLR4與腫瘤的發生、發展密切相關。Adam等[6]研究表明TLR4在胃癌、肝細胞癌、前列腺癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤細胞中表達，特別是TLR4的Asp299Gly基因多態性與腫瘤的發生發展高度相關。此外，TLR4在腫瘤細胞的凋亡過程中起重要作用。Cianchi等[7]發現TLR4通過抑制凋亡增強了腫瘤細胞的免疫逃逸。已有文獻報道在卵巢上皮癌組織及細胞系中，TLR4為陽性表達，為卵巢癌的治療提供新的治療靶點。

表1 TLR4表達與卵巢癌臨床病理特征的關系(例)

近年來發現卵巢癌組織中有多種因子表達,與腫瘤分期或者預后有關[8,9],本研究通過檢測卵巢癌組織中TLR4蛋白表達及mRNA水平，并且與癌旁組織及正常卵巢組織進行了比較，結果顯示，在卵巢癌組織、癌旁組織及正常卵巢組織中均有TLR4蛋白表達，且以卵巢癌組織中表達水平最高，這與Adam對胃癌、肝細胞癌的研究結果一致。卵巢癌組織中TLR4蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小及病理類型無關，但與腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況及FIGO分期有關，提示TLR4參與卵巢癌組織的惡性遠處轉移過程。

有研究發現，TLR4拮抗性配體白術內酯Ⅰ可以拮抗TLR4/MyD88信號通路介導的卵巢癌細胞IL-6的分泌，且可以選擇性增強紫杉醇對MyD88+卵巢癌細胞的生長抑制作用，為改善紫衫醇治療MyD88+卵巢癌提供1種新的思路和方法[10]。綜上所述，TLR4與卵巢癌細胞的惡性程度關系密切，激活的TLR4通路促進了卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移。

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[4] Zhou,McFarland-Mancini,Funk.Toll-like receptor expression in normal ovary and ovarian tumors〔J〕.Cancer Immunol Immunother,2009,58(9):1375.

[5] Woods,White,Dau.TLR4 activates NF-κB in human ovarian granulosa tumor cells〔J〕.Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,409(4):675.

[6] Adam P,Schmausser B,Miiller-Hermelink HK,et al.Gastric extranodal marginal zone B-cell lymphomas of MALT type exclusively express Toll 1ike receptor 4 in contrast to other lymphomas infiltrating the stomach〔J〕.Ann Oncol,2008,19：566.

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[9] 陳愛平，彭芝蘭.bcl-xl、p53蛋白在上皮性卵巢腫瘤中的表達及其臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志，2000，15(6):607.

[10] 王苗苗，黃建鳴，張國楠.白術內酯I拮抗TLR4/MyD88信號通路介導的卵巢癌細胞IL-6的分泌及增強紫杉醇誘導的卵巢癌細胞生長的抑制作用〔J〕.中華婦產科雜志，2011,46(4)：288.